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标题: 辟谣贴：关于“UPLC的骗局”一文 [打印本页]

作者: 北京-丹丹 时间: 2014-10-9 07:03 AM
标题: 辟谣贴：关于“UPLC的骗局”一文
辟谣贴：关于“UPLC的骗局”一文2014-10-08 [url=]液相达人馆[/url]

近几天在微信朋友圈中看到一条传播甚火的消息，叫做“UPLC的骗局”，文章中煞有介事的把UHPLC技术及相关仪器进行了一番批判，可以说是批判的体无完肤，而业内两间最知名的液相色谱厂商A和W公司也被卷入其中。

看过此文，馆长觉得这是一篇漏洞百出的牢骚贴，本来想一笑而过，可是不想这篇文章的传播有愈演愈烈之势，于是，我决定对他进行深入调查，对文中观点一一辟谣。

辟谣需要从源头开始，于是本人找来了在原帖中提到的一篇来自度娘文库中的文章，号称是这个帖子的理论基础和来源，看过之后，馆长乐了，乐的是，为啥生产UHPLC的厂商那么多，为啥只有A，W两家躺枪，这篇文章的成文年代推测大概是07，08年，那时候，市面上只有A,W两家有UHPLC系统，另外一家厂商S家正在推自己新的同类产品，但是性能上比起A，W又有些差距，于是找水军，或者是自己写了这篇水文，不想到，现在埋在地底多年的陈尸居然又被翻出来蛊惑人心，估计这篇文现在被S家的人看到自己都要气得吐血吧…

以上是以八卦的心态推测事情的始末，不过既然要辟谣，还是得靠严谨的态度和科学的论证，否则，辟谣就变成了伪科学打伪科学的窝里斗…

另外的一点是这篇文章是一片反面教材的典型，其中出现了很多偷换概念的地方，这些是很容易被混淆的概念，正好可以借辟谣之余帮助大家理清这些复杂的概念，提高大家的抗忽悠能力

先摆出帖子和度娘文库内容的连接供大家参考

帖子：http://bbs.instrument.com.cn/shtml/20140921/5466626

度娘： http://wenku.baidu.com/link?url= ... qEn7vKEtFlF3nGdPprW

下面馆长要对里面提到的五条“骗局”一一进行辟谣了，各位看官可以睁大雪亮的眼睛了，谨防忽悠：

在正式开始辟谣之前，还要再特别澄清两个缩写“UHPLC”和“UPLC”，前者是“超高效液相色谱（UltraHigh Performance Liquid Chromatography）”技术的英文缩写，也有人有把这个技术叫做“超高压液相色谱（UltraHigh Pressure Liquid Chromatography）”，但是这个说法太片面了，容易对使用者造成误导，所以现在很少有人再用了；而后者是W公司一款仪器的名称的缩写，使用UHPLC技术的仪器有很多，而UPLC只是其中的一款，就像啤酒有很多，但是青岛啤酒只是其中的一个品牌以牙膏，所以本文中所有涉及到技术的讨论都是用UHPLC这个技术术语，而不是用UPLC这个商品名称，下面正式开始辟谣

由于怕大家看一整个的长篇大论心烦，于是我把针对原帖里面的五个论点辟谣的具体内容分为五个分标题目放在后面，大家可以分开慢慢看：

”骗局一“的辟谣：压力和速度2014-10-08 [url=]液相达人馆[/url]

骗局1：伪高压

原帖：以WATERS为例。Waters的UPLC可用100 MPa (1,000kgf/cm2)的耐压时，送液泵的流量到1 mL/min．比其大的流量范围，即1～2 mL/min时，耐压只可用到50 MPa (500kgf/cm2) ―― 主要依据“压力与送液泵流量成正比”，因此流量越大，越需要高耐压，但Waters的UPLC在送液泵流量1 mL/min以上时，系统耐压规格下降一半。为此，Waters的UPLC是不完全的系统。

开始辟谣：

原贴说的UHPLC的骗局是“伪高压”，概括起来就是现在的UHPLC在高流速时候耐不到高压，只能在较低流速下保证系统耐高压，就像下面这张图里看到的，是个梯形

工作范围图：

确实如此，几乎现在所有UHPLC系统的压力-流速工作范围图都是这个模样，横坐标表示流速，纵坐标代表耐压上限

其实如果去翻看度娘的原文，在这段话之前还有很大的一段说明压力，流速，和分析速度的之间关系的说明，说的还挺正确，可以当作色谱科普读物看看，但是错就错在了最后的结论上，用正确的原理扭曲出了一个错误的结论，其实结论本身也没错，因为各家厂商在设计仪器的时候都是这么弄的，错就错在“伪高压”这个命题上

既然大家都设计成这样，那么这种设计就一定是有原因的，最大的原因其实是：用不上…或者说是不会有人这么用，为什么？

既然UHPLC是以提高分析速度和/或分离度为初衷的，那么我们就要考虑有什么因素会对速度和分离度有影响：

分离度受到柱效，选择性和保留的影响，这一点有公式为证

在从HPLC到UHPLC的技术转变中，真正改变的只有柱效一项，等长度的UHPLC色谱柱柱效大约是HPLC色谱柱的3倍，换句话说，只要用个1/3柱长的UHPLC色谱柱就可以达到和原来一样的分离效果

速度受到流速和色谱柱长度的影响：流速越高，色谱柱长度越短，分析的速度就越快，刚才，我们说过了UHPLC可以使用短色谱柱的原因，下面说一说高流速的使用：

这里，第一个被偷换的概念来了，那就是“流速“：

在液相色谱当中，我们通常用到的流速都是“体积流速“，就是mL/min这样单位的流速，表示色谱泵的输液速度，但是，决定分析快慢的并不是体积流速，而是”线速度“，是用cm/min这种单位表示的速度，是流动相带动被分析物质真正移动的速度，当然，这个速度是不考虑物质和固定相相互作用影响的。

举一个通俗的例子：汽车—线速度就是汽车移动的速度，而体积流速大概相当于汽车”百公里油耗“的概念，消耗的流动相，就相当于汽车的油耗。

百公里油耗和车的大小有关系，一辆大巴车和一辆小轿车开到相同的速度，一定是大巴车耗油更多，放到液相上，也是这个原理，柱子越大（色谱柱内径），要达到相同的分析速度，需要更多更多流动相消耗，所以就需要更大的体积流速。

在UHPLC分析中，我们可以通过提高流速来提高分析速度，但是很少有人会用到2mL/min以上的流速进行UHPLC分析，为什么呢？因为大家不想用这么多的溶剂，毕竟流动相不是自来水，点点滴滴都要花钱，既然小车可以跑的和大车一样快，还省油，何乐而不为呢？

所以在UHPLC分析中所使用到的色谱柱往往都是小内径色谱柱（小于等于3.0mm），这样可以使用更小的流速达到相同的分析速度。

至于为什还要保留2ml/min以上的的那一段缺角的空间，主要是为了出于仪器的兼容性，因为在经典的HPLC应用中，还是会有些方法要求使用到较高流速，但是对于这类应用，又不太可能使用到和UHPLC一样的高压了，所以耐压的上限也就相应降下来了。

最后，如果还有些星座的同学看着那缺掉的一角感觉不爽的话，我就只能吐槽下真相了，高压下的高流速泵液对于仪器设计确实有很大的挑战，但是不是无法实现，填补上这一角的代价就是使用更强力的马达，更耐压的材料，更好散热的柱塞杆，更…的…，概括成一句话就是：只要肯花钱，这些都不是问题。问题是，有人愿意为了不上那根本用不着的一角而多花几倍价钱去强化仪器的这些部件么？至少仪器生产厂商是不愿意为此买单的，任何一家厂商都不愿意…

“骗局二”的辟谣：热效应2014-10-08 [url=]液相达人馆[/url]

骗局2：高压下，分离恶化
原帖：使用高压LC时，Waters的销售宣传中的所谓“于一般粒径5μm色谱柱相比，未损害分离，分析时间缩短至1/9”，可用说理论上是正确的。
但是，看一看应用于实际分析的例子，分析时间确实缩短至1/9，但是可以说进行了未损害分离的分析吗？好像未必可得到所期待的结果。看一下Waters的分析例，有许多分离受到损害的例子，未能获得如其理论那样的结果，理由之一是“在色谱柱内部产生的摩擦热” ―― 在一般的LC中不会造成问题，但在高压条件下，流动相通过色谱柱内部时，在流动相和填充剂之间产生大量的摩擦热。并且，摩擦热引起色谱柱内部的温度偏差，其结果，峰产生扩散，分离恶化．可能是这个原因，看看Waters的分析例，在能保持分离的状态下的快速化，其实力不是缩短至1/9而只是1/4左右．但是，Waters一律未提及这种不充分的分离．只是分析标准样品的话，姑且不论，而在实际样品的分析中，因杂质的干扰多，这样不充分的分离可以说是致命的．这不仅是Waters的UPLC的问题，也是Agilent的1200系统的问题。
比如，食品领域的分析完全可以说是从杂质成分峰中分离目的成分的分析，因此，很难采用诸如Waters的UPLC、Agilent的1200系统的高压LC。

开始辟谣：

这纯属是前后自相矛盾的说法，度娘原文中已经花了很多时间讨论UHPLC在保持分离度的同时提高速度的原理，并且指出了这种方式的唯一副作用是“高压”，现在又蹦出来自己说高压状态下会恶化分离，这明显是自己抽脸的节奏嘛…

当然，作为一个技术型的辟谣者，如果只从文字上找错误，那就太跌份了，所以我们还要从原理上对谣言说不

在这一部分，谣言找到了一个新敌人用来攻击，那就是色谱柱内的热效应，首先还是要肯定谣言的开发者，这个效应确实存在，而且确实会对色谱分离产生影响，带来峰展宽。但是，凡事有度，这个效应到底带来多少影响，什么样的条件下这个效应的影响才会显露出来，是我们用来辟谣的关键：

首先，看一看热效应的产生：

这里就是热效应的示意图，这个色谱柱的剖面图，中间红色的部分表示较高的温度，由于摩擦热产生，随着向四周的传热，色谱柱最外层的温度会降低，形成温度梯度，这种温度梯度就是原帖中提到导致分离变坏的热效应

接着再来看看著名的范氏方程，研究一下温度对液相色谱的分离效能的影响到底有哪些：

H=A+B/u+Cu

其中的A，叫做涡流扩散，和色谱柱的填料形状及颗粒大小有关，不受温度影响；

B/u一项，叫做纵向扩散，主要受到流动相粘度和温度的影响，但是，在液相色谱中，流动相的粘度极大（与气相的气体流动相相比），而且温度也不会使用到很高（还是与气相动辄几百度的温度相比），所以摩擦产生的那点热，对于这一项的改变也非常小，另外非常重要的一点就是，在流动相线速度越高的时候，纵向扩散的影响会越小，所以，温度的影响又被流速抵消了一部分；

接下来，Cu一项，叫做传质阻力，这项的影响因素很多，但是总结下来，就是被分析物和流动相还有固定相发生交互作用的难易程度，温度对于这一项的影响在于，通常温度越高的时候，传质阻力越小，物质和两项发生的作用会更迅速完全。

所以，总结起来看，虽然温度会增加纵向扩散，但是由于能改善传质，所以它在液相色谱分析中，并不是一个坏分子，而是我们可以利用的参数条件

从理论层面来看，温度本身不一定会恶化分离，但是有一句话叫做“不仇富，仇不均”，原帖其实说的也是这一点，摩擦生热的产生的热量是均等的，从色谱柱的截面上来看，各个地方的摩擦产热是相同的，理论上应该是各个截面位置上由于生热产生的温度提高也是均等的，从这个角度来讲，热效应对于色谱的分离行为的影响是均等的，不过，这是理想状态，理想人人都可以有，但不是人人都能实现，色谱分离也一样，不能达到理想的原因是散热，散热会导致色谱柱外周由于摩擦产生的热量散失快，这样在色谱柱内部就产生了温度梯度，中心的温度高，四周的温度低，这种温度的梯度，是导致峰展宽的一个原因。

所以，这里就引出了问题的关键：传热，或者说散热，对于UHPLC来讲是个关键，如果色谱柱和仪器能够在很短的时间之内将色谱柱内所有的热量散出去的话，那么这种温度梯度就会消失，从而不会对色谱分析造成额外的影响。

其实，在分析级别规格的液相色谱当中，由于热效应产生的峰展宽，远远要小于其他因素带来的峰展宽，原因在于分析级别使用到的色谱柱的内径都很小，由于散热导致的温度梯度其实并不会太明显，另外就是由于色谱柱基本都是不锈钢材质的外壁，本身也增加了传热效率，最终，理想的热效应应该是这样的：热量随着流动相经过的路程增加，而不沿内径方向产生纵向的温度差：

最后，还是回到原帖的观点当中，尽然我们已经讨论过，由于摩擦热对分离的影响几乎可以忽略，那么原帖中借此为基础的得到的推论“高压下分离恶化”的错误结论也就不攻自破了。

最后的一件事，原文中举出了食品分析的应用作为支援其观点的实例，诚然，食品分析中遇到的样品基质都是相当复杂的，干扰极大，不过，样品分离的好坏，除了和仪器本身有关之外，还受到样品前处理方法和分析方法参数等多种因素的影响，仅仅说某个技术是否能适用某个应用领域是不全面的。

如果只看分离效果本身，UHPLC技术是否真的比HPLC强大很多呢？这其实是不一定的，具体原因我们会在下一条辟谣中提到。

”骗局三“的辟谣：压力和分离2014-10-08 [url=]液相达人馆[/url]

骗局3：分离不充分时，调整空间几乎不存在，且柱溫箱存在明显缺陷
原文：
使用高压LC进行了快速分析，但峰的分离不充分时如何是好呢？
一般可想到的措施有“利用长色谱柱提高分离”。但是，此时分离虽然提高了，但压力也上升了 ―― Waters、Agilent的高压LC在高压条件下进行分析，装置不能承受更高的高压，因此不能采用“长色谱柱”
其此，可想到的措施是“减小色谱柱填充剂的粒径，提高分离”。但是，进一步缩小粒径在技术上是困难的，而且，由于粒径的微细化，压力上升，则超过系统的耐压，因此也不能采用这个方案。
这样，Waters、Agilent的高压LC因进行快速分析而出现分离不充分的结果，但无法解决 ――这在理论上已经很明确，但如果说出来事实，则必须摘下“高压・快速LC”的招牌，因此Waters、Agilent选择沉默。
Waters、Agilent在销售宣传中说在“色谱柱填充剂的微细化(2μm以下的填充剂)”的延长线之上还有“色谱柱的高温化”，即在高温分析中高压LC是必须的．但是，“通过色谱柱高温化进行的快速分析”这是即使是一般的LC也可应对的方法。

本来，所谓“通过色谱柱填充剂的微细化实现快速分析”和“通过色谱柱的高温化实现快速分析”是以不同途径实现快速化，而Waters、Agilent却拿UPLC、1200系统的延长线之类的话来说事，其理由无非是躲开“依靠高压的快速・高分离是有极限的”这一事实。
【高压LC的问题：铝模块加热式柱温箱的缺点】
Waters的UPLC、Agilent的1200系统采用铝模块加热式的柱温箱．但是，这个类型的柱温箱不能高精度均匀地温控整个色谱柱，因此，在应用像高温分析这样强烈依靠温度的分析方法时，可以说很难得到期待的分离 ―― 在色谱柱内部产生温度偏差，其结果，峰产生扩散，分离悪化．比如，Agilent介绍了通过高温化进一步实现快速化的分析例．但是，从这个数据求出理论塔板数，则本来应该提高的理论塔板数反而比高温化前低．
这可以理解为在高温分析中的铝模块加热式柱温箱有极限．从很重视温度控制的GC采用空调式柱温箱来看，比起铝模块加热式柱温箱，空调式柱温箱具有高精度．

开始辟谣：

这里，原帖提到了UHPLC和HPLC技术当中最关键的差异——填料粒径，以及由于粒径变化导致的分离能力及系统压力的变化。

首先，对于分离能力的评估，我们可以理解为对样品的分离能力，对于简单样品，比如组份A和组份B这类情况的，就是看分离度，理解起来，就是A和B相互分离的程度，那么分离度受什么影响，可以看到以下的公式：

其中，N是柱效，a是选择性，而K是保留，其中和填料技术有关的的就只有N，柱效。

如果是复杂的样品，比如有几十个上百个组份混在一起的样品，看分离度是不行的，于是又有了新概念，叫做峰容量，就是分析方法在单位时间内理论上最多可以让多少个峰达到一定的分离度，说白了，就是分析方法在一定时间之内最多能分出多少个峰，

峰容量大概就是这么个意思了，一定时间内，一个方法理论上可以分离出的最多的峰的个数，当然，这只是一个理论上的最大值，虽然不能保证这个方法一定可以分离这么多峰，但是这个值越大，这个方法能把复杂样品中的物质分开的可能性就越大

那么，这个值受到什么影响呢？也有公式

对于等度方法

对于梯度方法

我们可以看到，对于等度方法，决定峰容量的是柱效N，对于梯度方法，决定峰容量的是峰宽和梯度时间，其中峰宽一项又在很大程度上取决于柱效，所以说，真正影响分离能力的参数只有两个：柱效，和分析时间。

下面，我们来看HPLC和UHPLC在这两方面的表现：

那么，既然是比赛，我们就要制定一系列的规则，在HPLC和UHPLC的比赛当中，很重要的一个限制因素是压力，所以我们先假定两种技术都在相同的耐压条件下且都是用到各自的最佳流速进行分析进行比赛，比如都是400bar，但是对柱长和分析时间都不做任何限制，只看两者谁能得到更高的峰容量（我们以梯度方法和复杂样品为考试项目），测试的结果是，HPLC胜，因为压力的限制（系统压力和填料粒径变化的平方成正比，粒径变化一倍，压力大概要变化4倍，就是说，等长度的UHPLC色谱柱产生的压力大约是HPLC色谱柱的8～9倍），及较高的最佳流速值，导致UHPLC模式无法使用很长的色谱柱，所以在柱效一项上败下阵来；对于HPLC方法，情况如何呢，由于较大的填料产生的系统压力比较低，所以HPLC可以使用非常长的色谱柱以提高柱效，大概可以用到1米以上长度的色谱柱和几个小时的分析时间，可以达到在这个压力状况下能得到的最佳分离能力。

那么，我们再来看另外一项比赛，如果系统压力上不封顶，但是规定比赛时间的话，谁的效果更好的呢？由于压力不再是限制，那么UHPLC在柱效这一方面上就不再吃亏了，柱效正比于柱长，而反比于填料粒径，就是说，等长度的UHPLC色谱柱的柱效大概相当于HPLC色谱柱柱效的3倍，换个角度，UHPLC只需要1/3的柱长就可以产生和HPLC相同的柱效，而分析时间正比于柱长和流速，由于柱长缩短，而且最佳流速提高，所以UHPLC可以在很短时间内得到比较高的柱效，而HPLC模式由于时间和最佳流速的限制，无法使用长色谱柱或者提高流速，所以在速度上败下阵来。

综上看出，HPLC和UHPLC技术在分离能力上其实是有不同侧重的，HPLC的强项在于长跑，而UHPLC的优势在于短跑，但是现在的分析方法对时间的要求很高，所以UHPLC方法在应用上更有实际意义，毕竟UHPLC可以在短时间内获得很大的峰容量，而且现在的仪器设计也能够满足UHPLC应用中对于压力的要求

讨论过各自的优势，我们回到原帖来看观点，关于分离效能的提升空间，首先，无论哪种模式或方法，分离效能都有一个能达到的极限，这个界限从现有的技术层面是无法突破的，这个界限来自于各个方面，压力只是其中之一，其他的可能还受到色谱柱长度，流动相种类等等条件的制约，对于HPLC模式，压力不是他的极限，而极限是分析时间的限制，现在谁还愿意接受一个需要运行1～2个小时分析一个样品的方法呢？另外，色谱柱的长度也是个限制，目前市场上能见到的最长的HPLC色谱柱绝大部分也不会超过300mm长，这就限制了在HPLC模式中通过使用更长的色谱柱获得更高柱效的途径，而在UHPLC方面，反而可以买到150mm长的色谱柱，这等效于HPLC模式下400～450mm色谱柱产生的柱效。

最后一件事要说到原帖中说到的另一个问题，柱温箱的设计，不过，我觉得这个事情应应该是放在上一个板块中说的，毕竟和温度有关嘛，不过，既然它不太合逻辑的在这儿出现了，那就在这里说吧：对于柱温箱的工作模式，其实无论是那种设计，我们之前已经讨论过，由于热效应的影响和快速的散热，任何一种原理的柱温箱都可以胜任到液相色谱的温度控制工作。

“骗局四”的辟谣：压力和性能2014-10-08 [url=]液相达人馆[/url]

骗局4：UPLC不能使用整体柱、严重牺牲LC基本性能，高压下存在耐用性差等问题

原帖：

以下为部分文章：
作为快速LC的特征，还有峰的响应性快．为追随快速地出峰，必须提高LC系统的响应性，但提高响应性则噪声增大．有关Waters的UPLC的灵敏度，宣传「与一般粒径5μm色谱柱相比，灵敏度提高3倍」，但未触及S/N比．这是因为灵敏度虽然提高了，但噪声也增大了，所以不能说S/N比． Agilent的1200系统，为提高LC系统的响应性，推荐从流路拆除送液泵的阻尼器和混合器．但是，拆除送液泵的阻尼器和混合器时，就会发生基线噪声增大或混合不充分的梯度结果． Agilent的1200系统缩短了检测池的光程．通过缩短光程可降低噪声，但信号强度的下降的更多，因此，其结果引起S/N比的下降．如上所述，高压LC牺牲了一般LC应有的基本性能．
比如，自动进样器中的六通阀是要求具有坚固性的部件．
一般，六通阀的耐久性能依存于技术规格上所规定的最大压力．并且，采用同样转子密封材质的六通阀，技术规格上的最大压力越高，维护频率增加．
转子密封的寿命(耐磨损性能)取决于六通阀制作时的闭紧压力，而不取决于分析时的送液压力．这是因为，无论是否进行流动相送液，在阀制作时调整的闭紧压力一直加载在转子密封上．为此，即使在低压下连续使用高压LC，寿命也不会延长．并且，装置的耐久性低则维护频率增加 ―― 高压LC时，用户难以自己进行维护，甚至消耗品的替换也需依赖于厂家．
于是，修理等待天数以及修理期变长，等待用户的是「以实现分析工作快速化为目的引进装置，装置不能运转的天数却增加了」这样讽刺的结果．并且，发生了以往本来不需要的维护费用．
Agilent1200系统，耐压为60 MPa (600kgf/cm2)，六通阀的维护频率与Waters的UPLC差不多 ―― Agilent的1200系统以及Waters的UPLC，六通阀的寿命都只有5,000次分析．

开始辟谣：

原帖说到了三件事：牺牲信噪比；高使用维护成本；以及无法使用整体柱（这项在原帖当中没具体说明，但是在度娘的原文里确实有详细解说）

辟谣开始：

信噪比确实是衡量灵敏度的硬指标，而且确实受到检测器基线噪音的影响，而检测器的基线噪音确实随着检测器采样速率的提高而提高，这些原帖用于攻击UHPLC技术的理论基础都是没错的，但可是，可但是，技术是在进步，现在的UHPLC系统所用到的检测器的噪音控制能力都以及比以往的HPLC系统有了很大的进步，能够保证即使在很高的采样速率下也能保证很低的噪音水平，这个大家只要看一看各家仪器的指标和验收参数就可以知道了。

接下来，从技术层面来讲采样速率对UHPLC的影响，这一部分也可以让大家明白一些UHPLC方法中检测器参数设置的原因：

首先，要解释我们看到的色谱图是怎么来的，当然是被检测器检测到的，不过，这个检测并不是样品分析结果真正的样子，而是检测器看到的样子，而检测器的采样频率，决定了到底可以把样品分析的结果看得“多清楚”

举个例子，比如两个人比武，如果对手是个街头混混，只会点三脚猫的功夫，那么过起招来，他的路数可以被看个一清二楚，见招拆招，可以赢得很轻松；如果对手是个武林高手，比如小李飞刀，根本看不到他出招，脖子上就已经挨了一刀，那就完蛋了。所以说，采样速率决定了仪器的武功能不能跟上对手（分析方法）的动作，HPLC的分离速度大概和江湖混混差不多，而UHPLC的出手基本上就是小李飞刀了。

既然知道了速度的重要性，到底多好的眼里才能跟上小李探花的速度呢？通常来讲，如果要准确描绘一个色谱峰，至少要保证在这个峰上采集到15～20个数据点，在HPLC分析中，一个色谱峰的宽度通常大概都是30～60秒，对于检测器来说，即使采用1Hz（每秒采集一个数据点）的采集速率，也可以收集到足够的数据点；但是对于UHPLC方法，色谱峰的峰宽普遍通常都在3～6秒，大多数情况下，超过10秒的峰宽已经算是奇葩一样的存在了，这样一来，1Hz的采样速率就远远不够了，所以我们就得提高采样速率。但是采样速率的提高又不能无限制的一直来，因为采样速率高了，基线噪音就要变大，所以提高采样速率的原则是：够用就好。

接下来，原文中还提到了为了减小延迟而减小混合体积从而导致基线噪音增加的问题，延迟体积的大小直接决定了梯度延迟时间的长短以及色谱柱在重新回到平衡状态时所需要的时间，而所有的的液相色谱产品，混合器的体积都是延迟体积的一部分，混合器的大小直接决定了溶剂混合的效能，这个混合效能又会直接影响到紫外类检测器的基线噪音水平，特别注意，是紫外类检测器

对于延迟体积，混合效能，分析速度和噪音水平这些事情，我们必须要知道的是：如果能把左右的项目都做到最好，要付出非常大的代价（这个大家可以去比较一下各家厂商顶级的UHPLC产品和入门级的UHPLC产品的价格就能明白了），所以，如何根据自己的真正使用状况选择最合适的UHPLC产品达到最好的性价比，才是更好的对待UHPLC的态度：

比如我们的实验室经常使用的是4.6mm内径的色谱柱用1mL/min的流速进行分析，那么一台延迟体积是500uL的仪器，它真正对方法造成的延迟时间是半分钟；但是如果我们使用2.1mm内径色谱柱用0.2mL/min的仪器进行分析，如果仍旧要求延迟时间是半分钟，那么仪器的延迟体就就要减小到100uL，这样就要改变仪器的流路设计，比如减小混合体积。这时候，原帖中的观点似乎起到作用了，混合体积小了，紫外基线噪音变大，但是，通常我们大部分时候都是在连接质谱检测器的时候才使用到这么细的色谱柱以及如此低的流速，而质谱检测器的基线噪音水品对流动相的混合充分与否是非常不敏感的。

所以，我们可以看出，对于仪器的选择和使用，只要我们考虑到我们使用的实际情况，结合仪器的特点，并不会出现原帖中所说的分析效果变差的情况。当然，随着UHPLC技术的普及，大家越来越多的考虑在搭配紫外类检测器的UHPLC系统上使用小内经色谱柱，这样就会对仪器的延迟，扩散还有检测器的采样速率及噪音控制能力有很大挑战了，当然，现在各个厂商的高端UHPLC产品，还是可以很轻易的满足这些要求的。

讲过噪音的产生，我们还要看看信噪比的另一个关键——信号，噪音越大，信噪比越差，灵敏度越低，不过，原帖中似乎忽略了UHPLC对于信号的提高：如果我们把色谱峰近似的认为是一个三角形的话，我们可以很容易发现：相同量的样品进入色谱柱，峰面积是一样的，但是，峰底宽越小，峰的高度会越高，因为三角形面积是正比于底边长和高的，面积固定，底边越小，峰高越大，这就意味着峰越“瘦”，它的峰高就会越大。

在UHPLC方法分析得到的峰通常都会比HPLC方法中瘦的多，因为物质在色谱柱上是受到“聚集”和“扩散”两个因素作用的，扩散和聚集，就像是跑步机和大盘鸡，永远是矛盾的存在…

“聚集”作用让相同物质尽量聚集在一起，是让峰变瘦的力量，这股力量，主要和柱效有关；而“扩散”作用，是和“聚集”相对的，是让峰变胖的因素，这个因素和物质在色谱柱内停留的时间有关系；在之前我们讨论过，要达到相同的柱效，UHPLC可以使用更短的色谱柱，而分析的时间又正比于色谱柱的长度，意味着，在聚集效果相同的情况下，UHPLC模式下的扩散更小，所以峰就更瘦，从而导致峰高更高，这就像是有些天生拉仇恨的人，光吃大盘鸡，不上跑步机，可还是瘦成一道闪电…可有些人，喝口凉水都要长肉…

废了好多话，刚说完灵敏度一件事儿，我们接下来还要说下运行和维护成本的事情：

首先，是使用寿命，尤其是原帖中提到的六通阀的使用寿命，虽然可能耐高压的阀的购买和维修成本是要比普通阀高一些，但是他们的使用寿命是一样的，并不存在人类社会里的“压力大死的快”的过劳死现象

从我个人的使用经验来看，UHPLC比HPLC使用成本高的一个主要原因在于样品处理的要求，因为HPLC的样品过滤通常使用到的是0.45um的滤膜，而UHPLC则要求使用0.22um的滤膜，这个成本上有点差异，其他的至于维修和配件，绝大部分并不存在UHPLC显著高于HPLC的现象，只要仪器使用维护得当，整体的维护成本并不会比HPLC高特别多，这就是像是平时注意养生保健，就不至于总要到医院去看病的道理一样。

既然说到成本，再多说一句，从长期的角度来看，UHPLC可以更有效的降低实验室的整体运行成本，主要是由于UHPLC节省了很多流动相：UHPLC通常可以用1/3长度的色谱柱取代原来的HPLC色谱柱，从而将分析时间和单个样品的溶剂消耗降为原来的1/3，在加上现在大家越来越多的使用性价比更好的3.0mm内径的色谱柱（相同分析速度仅需原来2/5的体积流速），又可以进一步降低溶剂的消耗，这样下来，单个样品运行的溶剂消耗会比原来节省近10倍，按照这个比例，大家可以计算一下一台仪器的使用寿命内，UHPLC到底可以比HPLC节省出多少溶剂，如果算上时间节省的成本，买台UHPLC还是非常值得的。

最后，关于整体柱，其实，UHPLC仪器并不对色谱柱的种类有要求，只要接口合适，柱温箱里放得下，任何色谱柱都可以接到UHPLC的系统上使用。整体柱，其实是一种新兴的色谱柱制造技术，使用了整体烧结的柱床取代了传统的颗粒填充柱床，它的优势在于具有类似UHPLC色谱柱的柱效，而压力几乎和HPLC色谱出差不多，这看起来，好像解决了所有问题，不过，大家有多少人用过整体柱呢？

很少吧，为什么呢？因为市面上能见到的商品化的整体柱太少了，比起全多孔硅胶技术的UHPLC色谱柱来说，可以说是凤毛麟角般的稀有。大家一定会问，为啥这么好的东西没人生产？这是因为，整体柱虽有千般好，但是有个致命的弱点至今还无法结局，从而限制了它的发展：这货的批间重现性太差…这跟这种色谱柱的制作工艺有关系，它的柱床是采用烧结技术制造的，在烧结过程中，很难控制所有参数的完全重现，即使是参数完全重现，也很难保证每批次间产品的性能完全一致，就像烤面包，即使保证了烤箱温度和烘烤时间一样，我们也不太能保证在发面和装盘的时候完全一样，因为这些因素是无法认为控制的。但是面包烤软点硬点都能吃，不过，作为一根色谱柱，问题可就大了，没人会希望看到换了个批号的色谱柱之后相同物质的保留时间漂上几分钟…由于这个软肋，整体柱的使用还是受到了极大的限制，这和使用什么仪器是没有半点关系的…

”骗局五“的辟谣：关于液质联用2014-10-08 [url=]液相达人馆[/url]

骗局5：高压LC的问题：无论作为MS前端装置的LC还是作为一般的LC都不合格
原贴：
只要不解决「交叉污染大」的问题，即使可以进行快速分析，也没有资格作为MS前端装置的LC ―― 这是因为越是像MS这样的高灵敏度，就越不能忽视交叉污染的影响．
并且，只要不解决「进样重现性差」，「分离不充分」，或「得不到充分的S/N比」等问题点，即使可以进行快速分析，作为一般的LC也是没有资格的―― 按照已有的LC合格的试验法进行分析时，因装置性能低，有可能变为不合格．
Waters和Agilent宣传UPLC和1200系统这样的高压LC「可用于一般的LC分析」，但在这种言辞背后隐藏了「但是，不能得到一般LC的基本性能」的事实．
这样，Waters、Agilent的姿态是，为了实现快速化，「基本性能即使与日立、日本分光等厂家的一般LC一样也没关系」．

开始辟谣：

针对最后的一点，可以说已经无力吐槽了，原帖只是把前面四个谣言里的观点做了一个总结性的的发言，只不过是把矛盾的焦点集中在了质谱联用的匹配性上，以吸引大家的眼球，大有“彻底堵死UHPLC的最后一条路”的气势。

除了已经在之前讨论过的关于分离度，灵敏度等等的辟谣之外，这里出现了另外的两个指标：交叉污染和进样重现性。

对于分离度方面，没有任何一家仪器厂商否认过液相分离对于质谱分析的重要性，而且所有UHPLC厂商的设计初衷也是在不损失或尽量提高分离效果的同时提高分析速度为前提的。

有关信噪比，之前我们已经说过，质谱检测器对于由于混合带来的基线噪音并不敏感，反而会随由于峰变瘦带来的峰高变高而变高。

接下来是交叉污染和进样重现性的问题，无论是在HPLC年代还是在UHPLC年代，这两个参数对质谱检测器都很重要，而且在UHPLC年代由于仪器设计的更新，这两方面的表现反而还要比HPLC年代的仪器表现更好：

交叉污染的干扰主要体现在是否能被检测器检测到，检测到了之后是否干扰定量分析的结果，在较差污染率相同的情况下，前者和检测器的灵敏度有关，后者和方法学要求有关。通常各个厂家用于连接质谱的自动进样器的交叉污染指标都已经可以达到万分之几的水平（这已经远远好于老型号的HPLC仪器），如果再配合上合理的方法设置，这个水平还可以更低，对于现有质谱的灵敏度或者方法学的要求，这已经足够了，并不存在UHPLC比HPLC退化的说法。

关于进样重现性的问题，UHPLC确实比HPLC遇到更多挑战，这个挑战主要来自于小体积进样时的精准度，因为之前我们已经讨论过，UHPLC使用的色谱柱柱体积通常比HPLC更小，所以相应的进样量也会更小，通常在UHPLC方法中很少会见到进样量大于10uL的方法，如何保证在如此小的进样体积下的精密度，这是个挑战，所幸的是，现在的UHPLC仪器系统已经很好的解决了这个问题，自动进样器重复进样的峰面积RSD都可以控制在1%以内，这个数值已经完全能够满足任何方法学所需要的精度要求了，反而是质谱检测器本身由于离子化效率，离子传输稳定性以及采样速率等问题带来的峰面积重现性反而成了结果误差的主要来源，当然，随着技术的进步，现在的质谱检测器在这些方面也已经有个长足的进步，UHPLC/MS的的方法学考察，要把峰面积的RSD做到2%以内也并不是什么难事了。

最后，辟谣五条之后，做一个简单的小结吧：

UHPLC技术并不仅仅是像看上去的那样“仅仅是压力提升”那样简单的升级，这个升级的过程就像是从固定电话到手机的变化，不仅仅是把线剪断那么容易，之中涉及的细节和技术原理十分复杂。

大家对UHPLC技术的恐惧很多情况下是来自于高系统压力带来的紧张，担心方法的稳定性，仪器的耐用性等等，这种恐惧很像是大家从坐绿皮火车到改坐高铁动车一样，只要做好仪器的使用维护，做好样品的处理，大家会发现压力和速度并不会让方法的稳定性变差

还有是关于一些“UHPLC不如想象的那样好”或者“UHPLC好像还不如HPLC好用”的问题，初次接触UHPLC，总可能遇到一些打击自己的问题，比如分离度表现不理想，色谱柱耐用性差等等，这些时候，就是要注意细节的地方了，比如做方法转换的时候是否注意到了色谱柱的选择性，检测器是否根据UHPLC方法的速度适当提高的采样速率等等，只要注意了相应的细节，相信大家都可以把UHPLC使好的。

最后的最后，如果大家能有耐心看完这些的话，我还想说下我对谣言的看法：

谣言的产生，源于大家对某些事物的不了解；

谣言的传播，源自大家对这些事物了解的渠道闭塞；

如果想破除谣言，就要有抽丝剥茧探明真相的态度，对于科学技术，其实真相很清楚，有时只是大家被谣言迷惑了视听，这一层假象的面纱，其实很容易被揭穿的。

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作者: 小苹果 时间: 2014-10-9 08:20 AM
技术帖，支持

作者: huaidanniuniu 时间: 2014-10-9 09:14 AM
支持一下！！

作者: lily 时间: 2014-10-9 01:26 PM
技术贴，支持一下。

作者: dhj1975 时间: 2014-10-13 01:10 PM
通过丹丹老师的这篇力作，对UHPL有了更加充分的认识，可惜因价格等方面的原因这项技术还无法快速普及，但是毕竟代表了HPLC技术的一个发展方向，还是值得大家一起研究的。感谢丹丹老师的分享

作者: 制药人5449 时间: 2015-1-28 04:22 PM
本人做液相的时间不长也不短，只想发表个人看法，首先UPLC的创新性是值得肯定的，普遍应用只是时间问题，但是，需要承认的是，不仅UPLC基础支持理论的完整性有待补充不说，而且在没有获得广泛的大量论据之前，做药的朋友明白，国家局对UPLC的认可恐怕再不像最初HPLC推出时那么顺利。

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