* | T) C! ?% ]' I+ n2.2 疫苗标准物质- T% e! K( [0 A* ?" F# H6 p5 N $ ]$ L; A. E) x, B ' u4 p* i! h6 G0 l. W; G- r, x 目前已建立的国家疫苗标准物质包括:EV71血清中和抗体国家标准品、EV71疫苗抗原国家标准品和EV71疫苗效力测定国家参考品。第一代EV71血清中和抗体国家标准品(2010国生标字0024),为健康人血清经冻干分装制备而成,包括强阳性(1000U)、弱阳性和阴性质控品组成,用于疫苗诱导中和抗体测定的质控。EV71疫苗抗原国家标准品(2010国生标字0023),为应用Vero细胞基质制备的EV71全病毒抗原(1600 U/ml),用于疫苗抗原活性测定的质控(25)。EV71疫苗效力测定国家参考品(2016国生参字0074),为应用Vero细胞基质制备的EV71全病毒灭活疫苗,经III期疫苗临床试验获得临床保护效果的数据,同时具有较好的稳定性,用于疫苗成品效力检定的质控(26)。 ; t( W$ z, P, A) k ) E ~1 b) ~ Y F$ J; J( q, t6 u; t$ E 2015年,WHO生物制品标准化专家委员会批准第一代EV71血清中和抗体国际标准品(1st IS for anti-EV71 serum (Human),批号:14/140),该标准品为健康人血清经冻干分装制备而成,每支含1000 IU,用于EV71疫苗诱导中和抗体测定的质控;以及低效价EV71 国际参考品(批号:13/238),300 IU/支,作为实验质控品(27)。目前 EV71疫苗抗原国际标准品正在研制中。建议疫苗生产企业依据国家标准品建立用于产品放行质控的参考品或对照品,应注意标准物质标定的可溯源性。9 g( K; y8 K) f) t8 w6 Q7 a6 ~ 2 V/ Z- F# { D R |# c7 y 7 E( f5 H4 l- B- n: [1 e% S ' e$ h8 A/ n6 c* ]1 h( S8 y, t4 ~, J: H0 i" {( p( a& z' A 2.3 生产用原材料 : B B% R% M& M. u, r. U2 S3 N( k* N+ ]: P, s* ]8 s2 v
~+ t3 f8 V0 \8 g8 OEV71疫苗生产中应用的种子批、细胞基质,培养基/培养液等原材料的质控标准应符合现行版《中国药典》的相关要求。应使用批准的工作种子批代次生产疫苗。主种子批和工作种子批应测定病毒滴度,疫苗株的主要保护蛋白VP1区核苷酸序列在不同种子批之间应不发生改变,以保证遗传稳定性,免疫原性检测标准为应用1针程序免疫小鼠,中和抗体阳转率应大于80%。应进行无菌检查、支原体检查和外源因子检查,保证无细菌、真菌、支原体及外源因子污染。2 q% k# G: k0 h; A $ f0 R5 S8 u0 f7 P/ F' D S5 q# i0 k+ L 只有经批准的细胞基质才能用于EV71疫苗生产,疫苗生产中应用的细胞基质包括已批准的二倍体和Vero细胞。WHO建议疫苗生产企业尽可能采用150代作为Vero细胞的限定代次(28)。主细胞库至少需进行反转录病毒实验、牛源或猪源病毒检查、致瘤性试验、无菌检查、支原体检查和外源因子检查等,同时应对细胞培养用牛血清的来源进行限定。: a# f: P! r4 Y& J0 K( B& A ; `4 Q" I2 C' ]2 r! c. B. o; q1 c) c; V. c - ?1 l5 C4 M- Z: M& M" L1 R' s) ?! k+ S# N; A 2.4 病毒接种、培养和收获 & u1 {8 L0 s- S, Q) ` # H9 L6 H3 w, V- g. a 8 a0 d6 R8 w) I3 J; I# J: S取EV71疫苗工作种子批毒种,按规定的MOI接种细胞基质,依据批准的温度、时间培养病毒并收获。单个收获物的储存应在批准的条件和时限内。同一细胞批生产的病毒液合并为病毒收获液。病毒收获液应按照连续生产过程进入后续的纯化处理工艺。样品收获后应立刻进行抽样检定。 - n; g1 m; y: z! n # d5 w" s8 ? l% H: `' y6 O0 E j1 r" R, E9 l7 k 3 E: ?' @% F4 c6 q% K . Q- p& h! M2 O! u7 r2.5 收获物检定! G$ x( U; a; L1 W% P: Z : W7 r1 F1 B f& o5 i I" t
& [1 @- z: V- B" l" m4 V4 N3 C/ p收获物的关键检定项目包含病毒滴定、抗原含量和蛋白含量测定,以及无菌检查和支原体检查等项,应分别符合批准的标准。生产企业应提供收获次数中单个生产收获物,以及合并收获物的各自一致性检测数据,并应符合已批准的体现质量一致性的标准。* t* X5 [ ~& \ 8 U9 z6 P6 V: z ! t1 w8 T8 o i9 d* z, Z) U! R1 F M |1 }8 |8 A# w, o) r - j3 @1 b9 N$ O, ~% N 2.6 纯化工艺 3 W6 Z7 I5 {4 X1 n& E3 v0 D8 q$ u( p) N
5 @) R6 x" r0 }; ]4 w4 u应采用批准的工艺进行EV71疫苗抗原的纯化,如色谱柱层析等。纯化的病毒液可进行合并和适当浓缩。纯化病毒液经滤膜过滤即为疫苗原液。当EV71疫苗原液因等待检测结果需暂存时,应依据前期稳定性研究的结果,按批准的保存方式和时间保存。 . r+ X x) L4 b8 m2 M x, h) K7 ?4 u9 P3 T# s, d& @% ^) R4 ?9 N 4 L3 ?+ O0 x% b0 [ # G1 u% j; f7 I( j& ~- E2.7 病毒灭活及验证 / N8 r: C6 e" y 4 @; P _8 `- S9 t3 E- J) m! @' U+ r) h, b: f) U7 k( G8 {. o q8 d) m 应采用批准的经验证的灭活剂和工艺进行EV71病毒的灭活,在限定总蛋白含量下,采用一定浓度的灭活剂,在确定的最佳温度下灭活足够时间,保证EV71病毒得到充分灭活。对每个病毒灭活容器均取样进行病毒灭活验证试验,按规定量,将EV71灭活液接种适宜细胞基质,35~37℃培养5~7天,冻融后同法再盲传2代,显微镜观察每代次应均无CPE。: K- b' u' u7 ]$ V2 U , m1 r8 X. K* S4 ^3 V' s* U) p' V3 q% U$ b+ q+ E3 H ) e7 B" |9 }7 I# k- |9 V/ n6 a4 k/ `" z2 U- C 2.8 原液检定+ L1 p. `5 b: E& z! m/ x5 p 4 ~; p: c! O) [! L + D6 g9 S# ]2 T+ Z$ N4 e! z% | 应采用批准的EV71鉴别实验、抗原含量等检测方法对原液和中间产物进行质控。抗原含量的检测多采用ELISA方法,需应用国家抗原标准品进行质控和含量赋值(U),也可自建对照品以监测测定结果的准确性。由于EV71疫苗为铝佐剂吸附疫苗,在成品中受佐剂以及蛋白稀释等因素影响的检定项目需在原液阶段进行。疫苗相关工艺杂质如牛血清白蛋白残留量、Vero 细胞蛋白残留量和DNA残留量,残留添加物如有机溶剂聚乙二醇6000、聚山梨酯80或Triton-X100等,以及非限制性核酸内切酶限度检定均应符合批准的限度。疫苗抗原纯度检测时原液中目标蛋白的纯度应不低于95.0%。应采用适宜的方法测定原液中可能潜在杂质蛋白的含量或比例,如SDS-PAGE或HPLC方法等。应关注抗原降解产物的鉴别和检测,考虑制定可接受的范围。病毒灭活验证试验时,将细胞盲传3代,应不得出现细胞病变。应证明无细菌、真菌、分枝杆菌和支原体污染。) P( v& z8 e9 A% G) l % d; H' S; [3 ]& d : J5 `: r$ C0 \% K0 u ; ^8 B/ A% L5 T5 C; P7 T. T( p; r% [. I7 c 2.9 半成品配制和检定7 _" k3 V% g* f* O 8 N5 G. L, z1 M. K; F) }0 r 8 E, \, l* B# u' R8 G( b 依据每批疫苗按抗原定量配制的要求,基于原液中EV71抗原的测定含量,以及成品疫苗的目标剂量,加入稀释液及氢氧化铝吸附剂,配制成目标剂量的半成品。由于EV71疫苗为铝佐剂吸附产品,半成品检定时除检测无菌、pH和氢氧化铝外,应测定EV71抗原吸附率。 " r8 M2 g* B; T, G8 w4 J+ B# E- R% @/ Y 5 h; K7 L* X; d% L$ B 2 }( k6 W% h/ Q& O `" O N
2 u2 i/ @* b; A3 k7 O; Y j2.10 成品分装和检定 J0 t5 \0 L) _3 M & |. H) }+ C; M0 y# v5 z 3 d7 P* v7 F6 B' ]! `依据企业注册标准和现行版《中国药典》进行分装、包装和检定。自建的方法需经批准,应用药典的方法需经过验证。疫苗成品质控项目包括EV71疫苗鉴别实验、外观、装量、无菌检查、细菌内毒素检查和异常毒性等指标;理化项目包括pH,氢氧化铝含量,游离甲醛含量以及渗透压摩尔浓度等指标。细胞培养液中添加抗生素时,需检测成品中抗生素残留量。疫苗的效力测定包括体内效力(ED50)以及体外相对效力,并测定中和抗体应答。疫苗抗原含量和中和抗体水平测定时需应用国家抗原和中和抗体标准品进行质控和赋值。抗原含量或效力测定标准的确定应综合考虑检测方法的误差,半成品配制操作过程中可能存在的偏差,以及成品在有效期内可接受的抗原降解。 ( a. F, \& x; l+ E( r 1 p- ^2 n- j& G7 \; A, O % v$ R% Y9 i3 w' O# L- v9 F9 Y( r! m1 U5 |7 G2 E ! J+ S8 U( T8 x 2.11 稳定性评价、储存和有效期/ l- l% [0 ~* J) q - {, R# w7 J; l' G# o' k4 ^ * ~$ w5 ~( p% y( o) V) b EV71疫苗为铝佐剂吸附疫苗,具有较好的稳定性。疫苗稳定性评价应依据WHO相关文件和现行版《中国药典》中人用疫苗总论等要求进行(4,29)。稳定性评价的类型包括实时条件下、加速稳定性、极端条件下及热稳定性研究,其中实时条件下稳定性研究为最基本的研究,疫苗获批后生产阶段一般选择在实时条件下的稳定性研究。按照《药品生产质量管理规范》(2010 年修订)中持续稳定性考察要求进行。通常情况下至少每年应当考察一个批次。中间产物稳定性评价目的为确定中间产物储存的条件和时间。成品稳定性评价则是确定疫苗的保持条件和有效期,并保证有效期内疫苗的有效性和安全性。EV71疫苗中间产物和疫苗成品的储存条件和时间应依据批准的标准执行。EV71疫苗为铝佐剂吸附疫苗,严禁冻结,因铝佐剂疫苗遭冻结后将永久性破坏免疫原性。; p- u+ |. k, R 9 D( H) Q, E3 |3 t& x9 \+ o3 e/ b# s6 V/ \0 \: P$ N. l2 K+ { 0 M* W) H9 _4 B l6 L2 R$ C5 \ % m+ K" w9 c, I! h 3. 疫苗批签发$ c* g4 n+ l3 L- ~3 H3 q 6 u" x6 T4 R/ J- B) ]/ c Z ' J$ j# J/ o+ F; ?疫苗批签发,是指国家食品药品监管部门对预防性疫苗在每批制品出厂上市前或者进口时,由指定的药品检验机构进行审核、检验及签发的制度(30)。我国疫苗批签发主要采用资料审核和样品检验相结合的形式。在批签发过程中,应特别重视对关键质量参数的趋势分析。应用趋势分析可发现某些批次疫苗出现偏差,启动调查并采取措施;考察生产过程中发生的变更对制品的影响(如工作种子批、设备)以及在一定生产周期内疫苗质量的变化趋势。因此疫苗批签发是确定疫苗生产一致性,保证上市疫苗有效性、安全性的必要手段。 ( q$ ?; q) B& J+ d' u5 J2 r* S, g1 r9 @. T: b: H! N
4 g! u( J7 J" w$ t( `1 ~; S" B 0 H/ M- @, m, p . a+ E* l2 e' y1 _" x( e, c3.1 EV71疫苗批制造及检定记录摘要应包括的主要内容及关键参数' s; f; G- i- ~: W2 K' y v ) }+ W& M, {1 u8 Y( [7 f- B
1 M; x1 e" u& m' d" W9 O4 t$ m- z企业应向批签发药检机构提供每批EV71疫苗的批制造及检定记录摘要。批制造及检定记录摘要应涵盖生产、检定过程中各环节的主要参数、经批准的企业名称、地址,及所生产疫苗的品种、批量和批号等,所提供的信息应确定、并可追溯。注明成品中起始材料、中间产物及半成品各个组分的失效日期;以生产流程图的方式,确认疫苗起始材料、中间产物、半成品和成品的唯一、合理的生产流程,生产流程应能追溯主要组分生产全过程;疫苗生产用毒株、二倍体细胞或Vero细胞基质的名称和代次应与批准的一致;证实疫苗生产工艺及规模、质控检测方法、质量标准,中间产物的批号、批量、保存条件等数据与批准的相同。关键工艺步骤操作参数、关键中间产物检测结果、目的产物收率应在可接受范围内;依据所提供的相关信息确认疫苗中活性组分含量等的理论值和实际值;提供疫苗起始材料、中间产物、半成品和成品的检测结果和质量标准,包括每项检定的结果;应提供检测的起始日期、方法、关键试剂,标准物质、工作参考品和对照品的列表以及相关的制备、标定和稳定性等关键信息。, A6 z \7 @, x' N) g3 @ , |1 Y+ ]! ]5 h0 a8 o 3 L v) g* N6 B: [4 _1 c4 M- Q $ J3 ^5 e+ f; p1 U8 Q/ X" `& M0 c( {- ~" q' P* W$ f3 J& O) E 3.2 EV71疫苗批签发趋势分析的技术要求 I* d$ ]# L2 }. U3 G ' c9 _' n \, }1 y: q2 q" I - v. N& f R. _# G0 z对EV71疫苗关键中间产物及成品活性成分和杂质的定量检测数据,均应进行趋势分析,如收获液病毒滴度,原液抗原含量、蛋白含量、纯度,成品体外相对效力、体内效力、理化指标以及可定量检测的杂质等项目;对于疫苗质控和检测中所使用的标准物质、工作参考品及对照品也应进行趋势分析。 & Q6 c: q; n6 c# b2 ^* T$ X S$ g+ A. |! k8 z# b! h/ ^0 Y! A " @0 d3 s2 t/ N- v$ ?0 `' D 生产企业应对EV71疫苗检验的所有关键性定量数据绘制趋势分析图。当疫苗检测批次结果的数量少于40个,应在至少6个连续批检验结果的基础上计算平均值和SD值,每个新的结果可添加并重新计算平均值和SD值。当批次结果数量等于或多于40个时,应根据至少10批不同原液得到最初的40个结果确定平均值和SD值。在其后持续进行趋势分析中不再随新增检验结果重新计算平均值,避免因引入新的检测数据而发生偏移。 ; z [ \! H7 C( F; {, _) c M; x+ ~' x
) @$ i5 b. c: }( l+ c! c+ G生产企业应确定疫苗质控关键项目趋势分析的警戒限和行动限。当出现1批疫苗检验结果超出行动限,3个连续批疫苗超出警戒限,或趋势有严重漂移,以及连续3至5批疫苗在均值一侧且接近警戒限时,应启动调查,查找分析原因,评估对疫苗质量的影响风险,确定相关批次疫苗是否予以放行,批签发机构依据同样的原则决定是否予以签发。 0 f% g# g7 @* t1 w d7 F* x: D$ y- J) N6 d
5 ^% _7 x! o" Z+ Z2 v, W应开展标准物质和对照品的趋势分析,目的是为监测EV71疫苗标准物质的活性,以进行检定实验室的质控。包括对应用国家标准物质的测定值,以及对企业用于疫苗质控和检测所自建工作参考品、对照品测定值的趋势分析等,应绘制趋势分析图,规定相应的警戒限和行动限。: E( {$ l: }" G: {% t : _2 {5 [% ~9 `2 I$ W# ~, T/ a1 T2 P+ W 应定期完成疫苗趋势分析和报告。EV71疫苗生产企业和批签发机构分别每半年或一年将各自检测关键项目的数据与前期数据进行比较。需比较批签发机构与生产企业的数据,结果分析时应考虑两者检定时的时间差异。 3 @5 h8 o0 J+ B; O/ w% z: W9 O# W; b |( s) W 0 ]; w6 B5 l1 n6 b , f% [5 |0 x- y. Y w: C
# o8 Z, Y. [$ P" |8 W; H; z起草单位:中国食品药品检定研究院生物制品检定所肝炎病毒疫苗室 3 \% @! b; r( t+ G9 y6 u Z% `: ?$ i* g, M! m m 5 b" F, z ?' X. F' y& u; P致谢:提出修改意见的各位专家及 3 家EV71疫苗生产企业& B7 i" L4 h1 v r6 Z5 O & A& M5 ]* M; E2 b/ N/ o# D 0 h2 n& M& O* H; N6 Q- y6 M/ _" \
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