CDE -生物制品稳定性研究相关问题的考虑 - 药群论坛

      药品稳定性是评价药品有效性和安全性的重要指标之一，稳定性研究是确定药品贮藏条件和使用期限的主要依据，也可以为药品的生产、包装、运输条件等提供科学依据。对于药品，特别是生物制品药品而言，其活性成分蛋白质或多肽的分子构型和生物活性的保持都依赖于各种共价和非共价的作用力，这些作用力的维持与其所处的微环境，如温度、光照、离子浓度和机械剪切力等存在着密切的关系，因此生物制品药物应开展严格全面的稳定性研究。稳定性研究是一个长期的试验过程，在整个产品研发周期中或是产品相关变更研究中，均是耗时较长的一项内容，因此提前做到全面、准确、合理的试验设计是稳定性研究成功的关键。本文拟以生物制品为例，初步探讨稳定性研究的相关问题，与业内人士共同交流和探讨。
      1.为什么要开展稳定性研究
      生物制品活性成分（API，active pharmaceutical ingredient ）的分子结构中通常含有多个活性基团，这些活性基团具有不同的化学不稳定性趋向，经常发生水解、酶解和氧化等化学过程，从而影响到产品的结构特性和生物活性等质量属性。因此，常见的稳定性研究的目的是为了了解药品原液或是制剂成品在各种环境影响因素下质量变化情况，特别是变性、失活等重要变化。影响因素包括温度、湿度和光照等。根据稳定性研究结果，建立药品贮存条件（storage conditions）、复验期（re-test periods）和有效期（expiry date）。稳定性研究结果还可以确定产品生产工艺、产品制剂处方和包装材料选择的合理性，并为产品质量标准的制定提供试验依据。
      除在产品研发阶段需要进行稳定性研究，在以下的一些变更情况中也需要开展稳定性研究，如：关键工艺步骤、工艺参数的变更；变更处方或者辅料配比；制剂辅料发生变更；内包装材料发生变更；生产地点、车间、生产线的变化；生产规模变更；增加新规格产品；变更产品贮藏条件或有效期及其他按照法规的要求进行的合理变更等。通过稳定性研究，了解产品的降解途径、降解速率和降解产物以及聚合条件等情况，以确定各项变更是否会影响到产品的质量，也可为变更的合理性提供试验数据。
      因此，稳定性研究是涉及到产品生产工艺、主药成分、辅料成分、包装材料、产品质量标准制定和产品相关各种变更研究的必不可少的一部分。其研究的结果反映了产品整个生产工艺过程和辅助材料的合理性，是直接决定一种药品是否能够成为上市产品的关键性研究。
      2.稳定性研究的考察条件
      根据稳定性研究的试验条件，稳定性研究可以分为强力破坏试验(影响因素试验)、加速稳定性试验、长期稳定性试验、模拟实际使用或运输情况稳定性试验等[1]。
      强力破坏试验是通过建立降解途径，鉴定可能的降解产物，以确定分子的内在稳定性，并提示该产品稳定性试验的最佳检测指标。强力破坏试验条件通常比加速试验条件更加激烈，主要包括高温、高湿、强光、反复冻融、强烈震动等。在产品可比性研究中经常采用强力破坏性试验进行对比分析，借助剧烈的试验条件，可以在较短的时间内观察到产品质量的变化，便于分析产品在质量和性质等方面的异同。
      加速稳定性试验一般是在较长期稳定性研究温度条件高（一般情况下，至少高15℃），并选择相适宜的湿度条件下进行的。加速试验研究可以为分析方法的验证、降解途径的阐明、敏感指标的确定以及未来开发工作研究和有效期制定提供依据。从加速稳定性试验中得到的数据，可用于估测如在运输期间或使用过程中发生短期的储藏条件与标签上规定不符可能会造成的影响。由于蛋白质结构十分复杂，可能同时存在多种降解途径，不同条件下的降解、聚合、变性、失活，以及与内包装容器之间的相互作用变化等稳定性情况各不相同，形成的变化产物谱系及其安全性风险程度也不一样，难以彼此替代，因此仅通过加速降解实验来预测生物制品药物的有效期并不可靠，加速试验结果仅可以作为复验期和有效期的辅助依据。
      长期稳定性研究是制定原液复验期和制剂成品有效期的依据，长期稳定性研究的数据可以说明产品在复验期和有效期内仍符合其质量标准。在长期稳定性研究中，任何一项检测值超出产品的质量验收范围，均视为不合格，产品在效期内的检测项目均应符合要求。
      模拟实际使用情况稳定性试验一般应用于多次使用药物的研究。一些粉针剂药物，在开启并溶解使用后，需要再进行保存并进行多次取药。稳定性研究中需要模拟实际使用的情况（包括储存条件、取样时间和取样量等），对每次取出样品进行检定，为药品保存条件和临床用药安全性提供依据。无菌检测是该研究中需要重点考察的项目。
      稳定性研究中考察时间的长短及放置条件应当充分考虑到今后的贮藏、运输及其使用的整个过程。稳定性考察时间的设置通常为，在规定的长期试验条件下，第一年每三个月测一次，第二年每六个月测一次，以后每年测一次。加速稳定性研究和强力破坏性试验一般分别设置为六个月和十四天，在此期间若没有观察到产品有明显的降解变化，可以适当的延长考察时间。稳定性研究中产品的放置情况有正置、倒置和横放等几种情况，应根据产品自身的特点进行设计。
      在开展稳定性研究过程中，还必须意识到产品可能会流通到不同的气候带，在研究设计中需要有目的地针对温度和湿度改变条件。在研究中，针对已确定的降解产物，应开展相关研究，明确其降解机理、分子结构、理化性质、生物学活性及其在临床应用中可能造成的影响等。另外，还需要关注聚合物的形成及带来的安全性风险。
      3.稳定性研究的考察项目和采用的方法
      目前，没有一项单一的稳定性试验方法或参数能够完全反应生物制品药物的稳定性特征，因此应采用恰当的物理化学、生物化学和免疫化学等技术对其活性成分（API，active pharmaceutical ingredient ）性质进行全面的鉴定[2]，考察项目设计要全面、合理，应包括在贮存时易变化，且有可能影响产品质量、安全性和（或）有效性的考察项目，如外观、理化性质、蛋白纯度、蛋白含量、生物学活性、杂质、无菌试验和细菌内毒素等，根据各检测项目变化情况对产品进行综合评价，其中生物学活性测定是稳定性研究的关键内容之一。根据产品剂型的特点，应设定相关的考察项目，如粉针制剂应考察其水分含量；液体制剂应考察其装量变化情况等。通过分析各个考察项目随时间的变化情况，以达到了解产品降解途径和产品敏感的环境因素。
      为了保证稳定性研究结果的真实可靠，稳定性试验的检验方法应经过方法学的验证，包括专属性、准确性、精密度、灵敏度等。稳定性研究中所使用的仪器，如恒温箱和恒湿箱等应经过严格检查和校验，并应定期开展监测。在贮藏过程中由于脱氨、氧化、磺酰化、聚合或降解等造成的分子变化，可选用电泳和高分辨率的高效液相层析以及肽图分析等方法。对于敏感的检测项目，可采用多种原理的检测方法从多个角度进行检测。如蛋白纯度项目的检测，可采用分子大小异质性分析方法、电荷异质性分析方法、氧化/疏水性为基础的分析方法等。
      4.稳定性研究的考察对象和考察批次要求
      原则上，在产品生产的过程中，凡涉及到不连续操作的步骤，其中间产物需要储存的都需要进行稳定性研究。常见的稳定性研究对象为中间体、原液、半成品和制剂成品。以PEG化长效生物制品为例，中间体在未进行PEG化前，常需要收集集中起来并进行保存，则此中间体的保存条件需要通过严格的稳定性研究结果来确定。PEG化反应及纯化分离后获得的原液，经原辅料配比后获得的半成品、及灌装和包装完毕后获得的制剂成品再分别开展相应的稳定性研究，以确定其保存条件和复验期/有效期。成品稳定性试验设计可以以原液的性质、原液稳定性研究和处方研究为基础，制定合理的稳定性研究方案。在少数特殊情况下，产品的生产工艺从生物体培养（如原核细胞、真核细胞等）开始到制剂成品灌装完成是连续的、无停顿的，无中间体、原液或是半成品的贮藏步骤，则仅需进行制剂成品的稳定性研究。
      稳定性研究批次的一般要求。加速和长期稳定性研究中应开展至少三批样品的研究。应用于稳定性研究的批次产品质量应具有代表性，生产工艺应与正式生产工艺相一致。实验室规模生产样品的稳定性数据，可作为辅助性资料，不能作为主要稳定性资料[3]。批次的选择：生产批次的前三批（工艺验证批）应进行稳定性研究，此后至少每年一批原料药/制剂（除非当年没有生产）需添加到稳定性监控计划中。用于稳定性研究的批次需为质量检验后的合格批次。应用于制剂稳定性试验的各批次产品应源于不同批号的原液。
      规格不同（浓度不同或装量不同）的同品种生物制品，在进行稳定性研究时，不能简单的相互替代。最高与最低浓度（或装量）的同品种制品应按照要求进行不少于三批产品的稳定性研究，中间浓度（或装量）制品可依据不同浓度规格之间的内在联系及相互支持适当减少研究批次，但是不能漏检[4]。原液长期稳定性试验所用的容器应当与实际贮藏和分装时的包装相同或相似；制剂长期稳定试验所用容器应该按上市时最终包装的要求进行。
      5.稳定性研究结果分析
      通过一个完整的稳定性研究，可以更好的了解活性物质固有的稳定性性质，制定合理的制剂处方、保存条件和有效期。产品有效期的制定需综合多批产品的影响因素试验、加速试验和长期试验等的研究结果，同时需结合药品在流通过程中可能遇到的情况进行全面的分析。
      目前，对于生物制品在有效期内的活性降低、物理化学性质变化、降解和聚合产物，尚无分门别类的提出最大可接受降低值的建议，应随不同制品的情况而定，但应不低于用于支持上市申请时的临床试验代表批次的检测结果。对于定量检测项目的验收限度，应根据临床前和临床研究中所用样品的总体研究结果制定可接受的限度，这个限度应包括单个及总的杂质和降解产物的上限，并依据对临床前和临床试验中所用药物的杂质水平来证明限度的合理性，制品在有效期内应符合其保证安全和有效的纯度和效价的范围。不同研究批次的稳定性结果需要进行统计学分析，以确定不同批次样品之间是否存在显著性差异，只有在经过统计学分析没有显著差异的样品中建立起的有效期才是准确、可靠的。
      稳定性研究是贯穿于整个药物研究阶段和支持药物上市及上市后研究的重要试验依据，该项研究资料不仅是法规的要求，也是药品安全性有效性评价的重要内容。稳定性考察应当是科学思想指导下，经过周密设计和全面分析研究基础上，获知生物制品储存期间质量属性变化特征的重要过程。以上系作者的分析思考意见，供业界相关人士参考。
【参考文献】
[1] 梅兴国主编. 生物技术药物制剂-基础与应用.化学工业出版社. 2004：73-81.
[2] ICH Q5c Quality of biotechnological products: stability testing of biotechnological/ biological products. 1995.
[3] ICH Q1a Stability testing of new drug substances and products.2003.
[4] 王军志主编. 生物技术药物研究开发和质量控制.第二版.科学出版社. 2007：400-402.

发布日期	20130703
栏目	生物制品评价>>生物制品质量控制
标题	生物制品稳定性研究相关问题的考虑
作者	韦薇、白玉、罗建辉
部门	生物制品药学部
正文内容	药品稳定性是评价药品有效性和安全性的重要指标之一，稳定性研究是确定药品贮藏条件和使用期限的主要依据，也可以为药品的生产、包装、运输条件等提供科学依据。对于药品，特别是生物制品药品而言，其活性成分蛋白质或多肽的分子构型和生物活性的保持都依赖于各种共价和非共价的作用力，这些作用力的维持与其所处的微环境，如温度、光照、离子浓度和机械剪切力等存在着密切的关系，因此生物制品药物应开展严格全面的稳定性研究。稳定性研究是一个长期的试验过程，在整个产品研发周期中或是产品相关变更研究中，均是耗时较长的一项内容，因此提前做到全面、准确、合理的试验设计是稳定性研究成功的关键。本文拟以生物制品为例，初步探讨稳定性研究的相关问题，与业内人士共同交流和探讨。, Y1 g" P* x1 ]7 Z$ {" \| 1.为什么要开展稳定性研究 0 Z) l- k# R8 F% l3 Y. M. H 生物制品活性成分（API，active pharmaceutical ingredient ）的分子结构中通常含有多个活性基团，这些活性基团具有不同的化学不稳定性趋向，经常发生水解、酶解和氧化等化学过程，从而影响到产品的结构特性和生物活性等质量属性。因此，常见的稳定性研究的目的是为了了解药品原液或是制剂成品在各种环境影响因素下质量变化情况，特别是变性、失活等重要变化。影响因素包括温度、湿度和光照等。根据稳定性研究结果，建立药品贮存条件（storage conditions）、复验期（re-test periods）和有效期（expiry date）。稳定性研究结果还可以确定产品生产工艺、产品制剂处方和包装材料选择的合理性，并为产品质量标准的制定提供试验依据。% E& j2 u r6 p. Q9 f4 @ 除在产品研发阶段需要进行稳定性研究，在以下的一些变更情况中也需要开展稳定性研究，如：关键工艺步骤、工艺参数的变更；变更处方或者辅料配比；制剂辅料发生变更；内包装材料发生变更；生产地点、车间、生产线的变化；生产规模变更；增加新规格产品；变更产品贮藏条件或有效期及其他按照法规的要求进行的合理变更等。通过稳定性研究，了解产品的降解途径、降解速率和降解产物以及聚合条件等情况，以确定各项变更是否会影响到产品的质量，也可为变更的合理性提供试验数据。, A# \|! J5 H2 ?. z4 x) @5 `+ k6 F7 A 因此，稳定性研究是涉及到产品生产工艺、主药成分、辅料成分、包装材料、产品质量标准制定和产品相关各种变更研究的必不可少的一部分。其研究的结果反映了产品整个生产工艺过程和辅助材料的合理性，是直接决定一种药品是否能够成为上市产品的关键性研究。 : r4 W9 ]" y& U4 U+ j: F 2.稳定性研究的考察条件 $ i8 ?! \|) L5 W+ }) N- i' P 根据稳定性研究的试验条件，稳定性研究可以分为强力破坏试验(影响因素试验)、加速稳定性试验、长期稳定性试验、模拟实际使用或运输情况稳定性试验等[1]。 + G8 A& J$ G% S7 s 强力破坏试验是通过建立降解途径，鉴定可能的降解产物，以确定分子的内在稳定性，并提示该产品稳定性试验的最佳检测指标。强力破坏试验条件通常比加速试验条件更加激烈，主要包括高温、高湿、强光、反复冻融、强烈震动等。在产品可比性研究中经常采用强力破坏性试验进行对比分析，借助剧烈的试验条件，可以在较短的时间内观察到产品质量的变化，便于分析产品在质量和性质等方面的异同。 / a% r& l. O0 ?4 `8 z5 v3 W+ \| 加速稳定性试验一般是在较长期稳定性研究温度条件高（一般情况下，至少高15℃），并选择相适宜的湿度条件下进行的。加速试验研究可以为分析方法的验证、降解途径的阐明、敏感指标的确定以及未来开发工作研究和有效期制定提供依据。从加速稳定性试验中得到的数据，可用于估测如在运输期间或使用过程中发生短期的储藏条件与标签上规定不符可能会造成的影响。由于蛋白质结构十分复杂，可能同时存在多种降解途径，不同条件下的降解、聚合、变性、失活，以及与内包装容器之间的相互作用变化等稳定性情况各不相同，形成的变化产物谱系及其安全性风险程度也不一样，难以彼此替代，因此仅通过加速降解实验来预测生物制品药物的有效期并不可靠，加速试验结果仅可以作为复验期和有效期的辅助依据。 - Y" }- A" i" @3 i2 ?9 F- r6 I& a 长期稳定性研究是制定原液复验期和制剂成品有效期的依据，长期稳定性研究的数据可以说明产品在复验期和有效期内仍符合其质量标准。在长期稳定性研究中，任何一项检测值超出产品的质量验收范围，均视为不合格，产品在效期内的检测项目均应符合要求。! ?9 w6 D2 H: e% S 模拟实际使用情况稳定性试验一般应用于多次使用药物的研究。一些粉针剂药物，在开启并溶解使用后，需要再进行保存并进行多次取药。稳定性研究中需要模拟实际使用的情况（包括储存条件、取样时间和取样量等），对每次取出样品进行检定，为药品保存条件和临床用药安全性提供依据。无菌检测是该研究中需要重点考察的项目。 * S" p2 _& v! \|' ~/ @- w 稳定性研究中考察时间的长短及放置条件应当充分考虑到今后的贮藏、运输及其使用的整个过程。稳定性考察时间的设置通常为，在规定的长期试验条件下，第一年每三个月测一次，第二年每六个月测一次，以后每年测一次。加速稳定性研究和强力破坏性试验一般分别设置为六个月和十四天，在此期间若没有观察到产品有明显的降解变化，可以适当的延长考察时间。稳定性研究中产品的放置情况有正置、倒置和横放等几种情况，应根据产品自身的特点进行设计。4 X( n0 U8 n5 c: t0 [1 \0 { 在开展稳定性研究过程中，还必须意识到产品可能会流通到不同的气候带，在研究设计中需要有目的地针对温度和湿度改变条件。在研究中，针对已确定的降解产物，应开展相关研究，明确其降解机理、分子结构、理化性质、生物学活性及其在临床应用中可能造成的影响等。另外，还需要关注聚合物的形成及带来的安全性风险。+ D" y; k: C' w/ J5 t8 _* V 3.稳定性研究的考察项目和采用的方法! P: j/ E, R/ T 目前，没有一项单一的稳定性试验方法或参数能够完全反应生物制品药物的稳定性特征，因此应采用恰当的物理化学、生物化学和免疫化学等技术对其活性成分（API，active pharmaceutical ingredient ）性质进行全面的鉴定[2]，考察项目设计要全面、合理，应包括在贮存时易变化，且有可能影响产品质量、安全性和（或）有效性的考察项目，如外观、理化性质、蛋白纯度、蛋白含量、生物学活性、杂质、无菌试验和细菌内毒素等，根据各检测项目变化情况对产品进行综合评价，其中生物学活性测定是稳定性研究的关键内容之一。根据产品剂型的特点，应设定相关的考察项目，如粉针制剂应考察其水分含量；液体制剂应考察其装量变化情况等。通过分析各个考察项目随时间的变化情况，以达到了解产品降解途径和产品敏感的环境因素。 + n% E% ~) T& \5 c* F 为了保证稳定性研究结果的真实可靠，稳定性试验的检验方法应经过方法学的验证，包括专属性、准确性、精密度、灵敏度等。稳定性研究中所使用的仪器，如恒温箱和恒湿箱等应经过严格检查和校验，并应定期开展监测。在贮藏过程中由于脱氨、氧化、磺酰化、聚合或降解等造成的分子变化，可选用电泳和高分辨率的高效液相层析以及肽图分析等方法。对于敏感的检测项目，可采用多种原理的检测方法从多个角度进行检测。如蛋白纯度项目的检测，可采用分子大小异质性分析方法、电荷异质性分析方法、氧化/疏水性为基础的分析方法等。0 n; ^4 j. \& O$ j& b! K 4.稳定性研究的考察对象和考察批次要求 6 f. n9 X6 x- _+ v, j! G 原则上，在产品生产的过程中，凡涉及到不连续操作的步骤，其中间产物需要储存的都需要进行稳定性研究。常见的稳定性研究对象为中间体、原液、半成品和制剂成品。以PEG化长效生物制品为例，中间体在未进行PEG化前，常需要收集集中起来并进行保存，则此中间体的保存条件需要通过严格的稳定性研究结果来确定。PEG化反应及纯化分离后获得的原液，经原辅料配比后获得的半成品、及灌装和包装完毕后获得的制剂成品再分别开展相应的稳定性研究，以确定其保存条件和复验期/有效期。成品稳定性试验设计可以以原液的性质、原液稳定性研究和处方研究为基础，制定合理的稳定性研究方案。在少数特殊情况下，产品的生产工艺从生物体培养（如原核细胞、真核细胞等）开始到制剂成品灌装完成是连续的、无停顿的，无中间体、原液或是半成品的贮藏步骤，则仅需进行制剂成品的稳定性研究。2 c* {, l% U! V1 Q, F7 o 稳定性研究批次的一般要求。加速和长期稳定性研究中应开展至少三批样品的研究。应用于稳定性研究的批次产品质量应具有代表性，生产工艺应与正式生产工艺相一致。实验室规模生产样品的稳定性数据，可作为辅助性资料，不能作为主要稳定性资料[3]。批次的选择：生产批次的前三批（工艺验证批）应进行稳定性研究，此后至少每年一批原料药/制剂（除非当年没有生产）需添加到稳定性监控计划中。用于稳定性研究的批次需为质量检验后的合格批次。应用于制剂稳定性试验的各批次产品应源于不同批号的原液。3 F8 d# a! A0 ]) L6 B+ U, q 规格不同（浓度不同或装量不同）的同品种生物制品，在进行稳定性研究时，不能简单的相互替代。最高与最低浓度（或装量）的同品种制品应按照要求进行不少于三批产品的稳定性研究，中间浓度（或装量）制品可依据不同浓度规格之间的内在联系及相互支持适当减少研究批次，但是不能漏检[4]。原液长期稳定性试验所用的容器应当与实际贮藏和分装时的包装相同或相似；制剂长期稳定试验所用容器应该按上市时最终包装的要求进行。! d( U6 H& c/ \|; y# h 5.稳定性研究结果分析 U P1 s' C( ]/ d$ P 通过一个完整的稳定性研究，可以更好的了解活性物质固有的稳定性性质，制定合理的制剂处方、保存条件和有效期。产品有效期的制定需综合多批产品的影响因素试验、加速试验和长期试验等的研究结果，同时需结合药品在流通过程中可能遇到的情况进行全面的分析。 7 U3 W, {, E2 J2 q' g: D 目前，对于生物制品在有效期内的活性降低、物理化学性质变化、降解和聚合产物，尚无分门别类的提出最大可接受降低值的建议，应随不同制品的情况而定，但应不低于用于支持上市申请时的临床试验代表批次的检测结果。对于定量检测项目的验收限度，应根据临床前和临床研究中所用样品的总体研究结果制定可接受的限度，这个限度应包括单个及总的杂质和降解产物的上限，并依据对临床前和临床试验中所用药物的杂质水平来证明限度的合理性，制品在有效期内应符合其保证安全和有效的纯度和效价的范围。不同研究批次的稳定性结果需要进行统计学分析，以确定不同批次样品之间是否存在显著性差异，只有在经过统计学分析没有显著差异的样品中建立起的有效期才是准确、可靠的。 ) F" H& S1 H9 L" S8 b 稳定性研究是贯穿于整个药物研究阶段和支持药物上市及上市后研究的重要试验依据，该项研究资料不仅是法规的要求，也是药品安全性有效性评价的重要内容。稳定性考察应当是科学思想指导下，经过周密设计和全面分析研究基础上，获知生物制品储存期间质量属性变化特征的重要过程。以上系作者的分析思考意见，供业界相关人士参考。 , C) t v s& M* L% k【参考文献】- Z2 Z5 X$ b9 \# P1 m# c [1] 梅兴国主编. 生物技术药物制剂-基础与应用.化学工业出版社. 2004：73-81. % a- G/ l* Q# c[2] ICH Q5c Quality of biotechnological products: stability testing of biotechnological/ biological products. 1995.& ~, ]' `2 p6 q5 M- ~7 V [3] ICH Q1a Stability testing of new drug substances and products.2003. 7 z0 l1 v1 e0 T5 S& ^[4] 王军志主编. 生物技术药物研究开发和质量控制.第二版.科学出版社. 2007：400-402.
备注	本文已发表在中国新药杂志：2013,22（4）390-393，此处系全文转载。