2020药典学习笔记-1143细菌内毒素检查法

11 4 3 细菌内毒素检查法

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注：该检查法变化不大，可结合指导原则 9251《细菌内毒素检查法应用指导原则》（新增，见文末学习内容）一起学习；能够扩展更多背景知识。

本法系利用鲎试剂来……，1E U 与1 个内毒素国际单位(IU)相当。

细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制，并以细菌内毒素国际标准品标定其效价。用于标定……光度测定法中标准曲线可靠性试验。

细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml(用于凝胶法）或小于0. 005EU/ml(用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。

学习：通常，按照药典此条款和GMP相关要求，需要对采购的检查用水进行要收和检验。至少应该做到理化指标，其它应该进行必要的审计和索取厂家报告单。当然，最好的情况是全项检验（你具备此内毒素限值的检验能力吗……）

鲎试剂是从鲎的血液中提取出的冻干试剂，可以与细菌内毒素发生凝集反应。除了内毒素，鲎试剂还与某些(3-葡聚糖反应，产生假阳性结果。如遇含有(β-葡聚糖的样品，可使用去G 因子鲎试剂或G 因子反应抑制剂来排除鲎试剂与β-葡聚糖的反应。

学习：这一段是新增内容。增加了检验原理的简介，明确相关反应的干扰因素，指明去除干扰的两种方法。根据相关研究进展其实还有新的检验方法……《中国药典分析检测技术指南》介绍比较像详细。这也不是新知识点，有相关品种的需要注意，此类假阳性的问题。

试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。耐热器皿常用干热灭菌法（250°C 、至少3 0 分钟以上）……并且对试验无干扰的器具。

学习：删除“以上”，挺好不啰嗦了。

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供试品溶液的制  某些供试品……在已去除内毒素的容器中配制。所用溶剂、酸碱溶液及缓冲液应不含内毒素和干扰因子。

学习：删除“缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子”的表述，换成上述标绿内容。那么是否意味着溶剂、酸碱溶液及缓冲液向着购买商品装更进一步了呢？以免自己无法证明所用材料“内毒素和干扰因子”。

内毒素限值的确定  ……

确定最大有效稀释倍数（MVD)  最大有效稀释倍数是……许达到稀释的最大倍数（1→MVD），在不超过此稀释倍数的浓度下……。

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学习：删除标红内容，删了也就删了吧。貌似内毒素检极低的最好选择热原法。

方法1 凝胶法

……

鲎试剂灵敏度复核试验

在本检查法规定的条件下，……应进行鲎试剂灵敏度复核试验。

根据鲎试剂灵敏度的标示值(λ)，将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟或参照标准品说明书中要求的混匀时间进行操作，然后制成2λ 、1、0.5λ和0. 25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒或参照标准品说明书中要求的混匀时间进行操作。取不同浓度的内毒素标准溶液，分别与等体积（如0.1ml) 的鲎试剂溶液混合，每一个内毒素浓度平行做4 管；另外取2管加人等体积的细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混勻后，封闭管口，垂直放人37°C±1°C 的恒温器中，保温6 0 分钟士2 分钟。

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学习：标红为新增的选项，核对说明书。标准品的实践使用过程中，需要经常性再次混匀约不少于30秒；若多批样本间样品阳性制备间隔时间长，再用前应适当时间再次混合。目的是避免内毒素自身的**现象干扰检验。特意看了一下中检院的说明书（文末有附）：“注意：1、使用时加入细菌内毒素检查用水1ml，复溶后置旋涡混合器上混匀15 分钟。2、本品为一次性使用。3、本品稀释按以下方式进行，每步置旋涡混合器上混匀30 秒……其余可根据情况而定。”

小调查：通常“封闭管口”用封口膜，你们呢？  恒温器可以是水浴锅吗？我用的是某斯的专用定温定时设备。

将试管从恒温器中轻轻取……当最大浓度2λ管均为阳性……按下式计算反应终点浓度的几何平均值……

学习：几何平均值。又看到统计学知识，昨晚看了休闲区的一个帖子……不想说了。做了一个计算表，还没有按xxx程序进行确认。贴个图先，整好了发上来。留坑。

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干扰试验  ……

……

当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项的品种建立内毒素检査法时，须进行干扰试验。

当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。

……

学习：对于新品种，干扰试验时，两家企业的鲎试剂对不少于三批进行干扰试验。这不是新闻了，但还是要注意一下。9251《细菌内毒素检查法应用指导原则》表述更明确。在上几版的“标准操作规范”中均如此表述。不想拓展了，打字累。

检查法

(1)凝胶限度试验

……。若溶液A 的两个平行管中的一管为阳性，另一管为阴性，需进行复试。复试时溶液A 需做4 支平行管，若所有平行管均为阴性，判定供试品符合规定，否则判定供试品不符合规定。……

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学习：你的SOP中设计复检记录了吗……。注意：药典规定了复检方案的，OOS调查时候不要整什么幺蛾子。

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(2)凝胶半定量试验  ……

方法2 光度测定法

……(3) 阴性对照吸光度小于或透光率大于标准曲线最低点的检测值或反应时间大于标准曲线最低点的反应时间。

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学习：增加的这个内容考虑了不同厂家仪器的检验原理。

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结果判断  若供试品溶液所有平行管的平均内毒素浓度乘以稀释倍数后，小于规定的内毒素限值，判定供试品符合规定。若大于或等于规定的内毒素限值，判定供试品不符合

规定。

因指导原则 9251《细菌内毒素检查法应用指导原则》是新增指导原则，等待专家解读。需要关注的几点是：

……

2. 细菌内毒素检查方法的选择

(2)光度法  度法光度法（包括浊度法和显色法）可定量检测内毒素的含量，能较为准确评估产品在生产过程中污染的相对风险，定量检测的数据不仅有利于追踪产品质量趋势，还能起到风险预警的作用，达到数据完整性的要求。

供试品能否采用光度法进行检测，须通过干扰试验确定。光度测定法可通过回收率判断出干扰的趋势，尤其对于研究性质的样品（如新产品）更具有优势。

由于光度法的检测范围比凝胶法宽，使得有干扰的样品可以有更大的稀释倍数，对于部分使用凝胶法无法排除干扰的样品，可以尝试使用光度法建立细菌内毒素检测方法。

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学习：好像数据完整性越来越好玩了。虽然定量方法很ok，别忘了，通用技术要求中可是明确指出：“。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准”。当然，你可以活学活用“另有规定”。

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4. 产品细菌内毒素检查法的建立

建立品种的细菌内毒素检查法时，为验证样品和不同生产厂家鲎试剂反应的一致性，应使用两个生产厂家的鲎试剂对至少三批样品进行干扰试验。

建立产品细菌内毒素检查法时，若无法排除供试品对细菌内毒素检查的干扰作用，或只能使用最高灵敏度鲎试剂(凝胶法为0.03EU/ml, 光度法为0.001EU/ml)才能排除干扰，则该品种不宜建立细菌内毒素检查项。

5. 其他

目前新的细菌内毒素检测方法不断出现，以适应特殊品种细菌内毒素检查的需要，或减少鲎试剂的使用量。如重组C 因子法（见附）、微量凝胶法等。当采用细菌内毒素检查法(通则1143)中未收载的方法检测产品的细菌内毒素时，应符合“凡例”的相关规定。

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学习：四部凡例中的要求抄录此地：“检验方法和限度  二十一、本版药典品种正文收载的所有品种，均应按规定的方法进行检验。采用药典规定的方法进行检验时，应对方法的适用性进行确认。如采用其他方法，应进行方法学验证，并与规定的方法比对，根据试验结果选择使用，但应以本版药典规定的方法为准”。也即，用可以，要对比，最终还是药典方法为准。

留几张图吧，细节自己去看我的系列图

                               
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本文为转载文章，文中观点代表作者个人的理解。