【旧时光】生化药物质量控制研究中应注意的问题

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生化药物质量控制研究中应注意的问题

发布日期：2005年1月14日

作者：霍秀敏 罗建辉

部门：审评二部

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生化药物是从生物体分离、纯化所得的用于预防、治疗和诊断疾病的生化基本物质，以及用化学合成、微生物合成或现代生物技术制得的这类物质。生化药物有两个基本特点：其一，它来自生物体；其二，它是生物体中的基本生化成分。生化药物的生化基本物质主要包括氨基酸、肽、蛋白质、酶及辅酶、多糖、脂质、核酸及其降解产物，这些成分均具有生物活性或生理功能。

因生化药物源自生物体，其来源复杂、组成不明确，单靠质量标准无法有效地控制产品的质量。故控制原材料的来源和工艺过程，再加上原液（或半成品）和/或终产品（成品）的质量标准才有可能较好的控制产品的质量，保证临床应用的安全和有效。

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目前，国内在生化药物的研究方面存在较多的问题，主要表现在以下几个方面：

1、对原材料没有进行严格的控制；

2、无病毒灭活的工艺步骤；

3、质量研究内容不够全面等。致使审评人员难以把握其质量，且产生了更多的安全性担忧。

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下面从生化药物的一般制备方法、工艺过程和质量研究，以及在研究过程中应注意的问题等方面谈一谈自己的看法，以期与有关同仁共同探讨，共同提高。

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一、生化药物的制备方法

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生化制药就是将动物、植物或微生物机体内的生物活性物质在其结构和功能不遭破坏的前提下，采用多种生化分离的方法提取、纯化的工艺过程。

生化制药的六个阶段：

1、原料的选择和预处理；

2、组织及细胞的破碎；

3、从破碎的细胞中提取有效成分制成粗品；

4、采用多种生化技术从粗品中将目的物精制出来；

5、干燥及保存；

6、制剂。以上各阶段在不同的生化药物制备中，根据所选材料的不同，可灵活取舍选择使用。

生化药物的分离纯化方法主要有五类：

1、根据分子大小和形状不同进行分离，如凝胶过滤法、透析和超滤法、密度梯度离心法等；

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2、根据分子的带电性质进行分离，如离子交换层析法、电泳法、等电聚焦法；

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3、根据分子极性大小及溶解度不同进行分离，如等电点沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法、逆流分配法等；

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4、根据配体特异性进行分离，如亲和层析法；

5、根据物质吸附性质不同进行分离，如选择性吸附和吸附层析法。

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二、生化药物质量控制研究要点

生化药物复杂多样，在此仅针对脏器提取的多组分生化药物进行讨论，其它生化药物可参考。

（一）、脏器生化药物

脏器生化药是指从动物来源的生化药物，即从动物的组织、器官、腺体、体液、分泌物以及胎盘、毛、皮、角和蹄甲等提取的药物。脏器生化药物中多数有效成分不明确，多属高分子物质，现在多数还不能用合成的方法生产，有的物质还需要有同时存在的其它物质的协同作用才能发挥较好的生理功能。

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主要的脏器生化药物

1、 组织和器官来源

大脑：胆固醇、脑磷脂、卵磷脂、P-物质和多种脑啡肽等；

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丘脑：生长激素释放因子和生长激素抑制因子等；

心脏和动脉管：细胞色素C、辅酶Q10和辅酶A等；

肝脏：核糖核酸、肝注射液、肝提取物、肝水解物和辅酶A等；

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肺脏：抑肽酶等；

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脾脏：脾注射液、肝－脾提取物和脱氧核苷酸钠注射液等；

胃：胃膜素和胃蛋白酶等；

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肠及肠粘膜：P-物质、肝素和其它肝素（低分子肝素）等；

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眼：眼生素和眼宁等全眼提取物；

骨：硫酸软骨素、硫酸软骨素A、骨肽注射液和蛋白胨等；

皮：明胶和阿胶等；

2、 腺体来源

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脑垂体：促皮质素、促卵泡激素、促黄体生成激素、生长激素、促乳激素、催产素、加压素和垂体前叶激素等；

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胰腺：胰岛素、胰高血糖素、胰蛋白酶、糜蛋白酶、结晶糜胰蛋白酶、胰酶、蛋白酶抑制剂、激肽释放酶（血管舒缓素）、弹性酶（弹性蛋白酶）、胶原酶、胰类肝素等；

唾液腺：唾液腺素等；

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颌下腺：激肽释放酶等；

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腮腺：腮腺素等；

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甲状腺：降钙素、甲状腺素和干燥甲状腺提取物等；

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胸腺：胸腺素（胸腺肽）、胸腺生成素Ⅰ、Ⅱ和胸腺体液因子等；

肾上腺：肾上腺皮质激素等；

甲状旁腺：甲状旁腺素等；

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卵巢：松弛肽和子宫松弛因子等；

睾丸：透明质酸酶等；

松果体：松果体激素等；

3、 体液和分泌物来源

血液：组氨酸、赖氨酸、精氨酸和水解蛋白等；

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胆汁：人工牛黄、去氢胆酸、鹅去氧胆酸、胆酸钠、胆黄素等；

尿：尿激酶和绒毛膜激素等；

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4、 其他来源

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胎盘：胎盘提取物、胎盘球蛋白和白蛋白等；

毛：胱氨酸、半胱氨酸、赖氨酸和精氨酸等；

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角和蹄甲：羚羊角、犀角代用品和妇乐宁等；

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蛋：溶菌酶等。

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（二）、脏器生化药物的研究和质量控制要点

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因动物的来源复杂（包括动物的种属、健康状况、饲养环境、年龄、采集时间、采集方法等），提取纯化工艺简单，其有效成分的含量和比例会产生较大的差异，因此，单靠质量标准不能全面控制产品的质量，而需要控制源头和工艺过程，再结合质量标准才能较有效地控制产品的质量，确保临床应用的安全性和有效性。换句话说，生化药物的质量控制重点就是要保证生产产品与临床研究样品质量一致，这种质量的一致性单凭质量标准中的质量控制指标不能全面地反映出来（这一点不同于化学药物），必须通过严格地控制源头和工艺过程来实现，这一点类似于生物制品。

1、脏器生化药物研究的一般过程

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研究脏器生化药物首先要固定源头（原材料），包括动物的种属、健康状况、饲养环境（封闭饲养）、年龄、采集时间和采集方法等，并制订原材料的质量标准。然后研究合适的提取纯化方法，包括动物源性病毒的灭活和验证，确定原液（或半成品）的生产工艺；研究原液（或半成品）中的主要成分、含量、主成分的比例，以及其它成分的控制方法等，制订原液（或半成品）的质量标准。进行制剂的处方工艺研究，最后制成临床应用的制剂（成品），并进行相应的质量研究，制订成品的质量标准。

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2、动物源性病毒的灭活工艺及验证

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因组织来源动物的种类不同，其自然携带或者感染病毒的种类也会有所不同，再加上目前动物来源的原材料可控性较差，故必须要对动物源性病毒进行灭活或去除，并对灭活或去除工艺进行验证。

灭活或去除动物源性病毒，首先要了解选定动物的病毒情况，重点关注已确认对人类具有感染和致病能力的病毒（例如牛和猪的口蹄疫病毒，猪的乙型脑炎病毒等）及已有试验提示与人类疾病具有关联性的病毒（例如牛腹泻病毒，猪的戊肝病毒等），了解病毒的生物学和对理化因素敏感性等方面的特性。检验原材料中病毒的污染程度和负载量，为采取相应的处理工艺提供研究数据。如果已知原材料中污染了对人感染或者致病的病毒，或者检出了内源性逆转录病毒、具有种属特异性的其它污染病毒，则必须废弃该原材料并妥善处理。

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（1）病毒的检测方法

病毒的检测方法主要有体外法（采用不同种属的多种敏感细胞系进行共培养检测，在适宜的培养时间点取样检测感染性病毒，至少应盲传3代）、体内法（在没有可靠的体外试验方法时，可采用适宜的动物进行接种盲传试验，采用敏感的方法检测感染性病毒）、动物抗体产生试验（对尚没有合适的体内和体外试验方法检测的病毒，可采用不同动物观察种特异病毒的抗体产生情况，抗体产生试验特别有助于检出啮齿类动物病毒）、其他方法（电镜、ELISA、PCR、RT方法等）。病毒的检测方法应结合品种的特点和具体生产情况，综合分析后进行设计和选择，通常应有合理的依据和支持性资料。

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（2）病毒灭活/去除工艺

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尽量设计与实际生产工艺相关的及合理的病毒灭活/去除研究试验方案，尤其是特定的生产工艺步骤，模拟的工艺在试验参数及控制条件方面应与实际工艺严格保持一致。也就是说模拟的生产工艺应当尽可能代表实际生产工艺的情况；如果产生了不可避免的偏差，应对试验结果可能产生的影响给予合理的解释。有关病毒灭活/去除的技术方法，可参见《血液制品病毒去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》。

（3）病毒灭活/去除工艺验证研究

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病毒灭活/去除工艺验证研究的目的是要获取充足的试验研究数据，以证明生产工艺中包含有效的病毒灭活/去除工艺步骤。其基本原则是生产工艺必须包含有效的病毒灭活/去除工艺步骤，若生产工艺无有效的灭活/去除病毒的作用，应根据产品的不同，在生产工艺过程中增加特定的病毒灭活/去除步骤。对脏器生化药物应包含两种机制上能够互补的有效工艺步骤。

经过多年的实践，已经获得普遍认可的作法是将已知量的指示用活病毒，加入到模拟的原液或者不同生产工艺阶段的中间产品中，然后定量测定经特定工艺步骤或技术方法处理后病毒滴度下降的幅度，据此评价工艺灭活/去除病毒的效果。

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一般验证采用普通指示病毒，试验结果用于说明工艺步骤对一般病毒的灭活/去除能力，在适宜的范围内能够代表对同类病毒相似的清除能力；特定验证采用特定病毒（已发现的污染病毒）或者与特定病毒相似的病毒作为替代，试验结果用于说明工艺步骤对特定病毒的灭活/去除能力，生产工艺必须具有足够的清除该病毒的能力。因为特定病毒与一般病毒在理化因素敏感性、病毒结构特点、病毒颗粒大小及其它方面有差异，因此，普通指示病毒与特定病毒或特定病毒相似的病毒不具备可比性和一致性，难以互相替代。

（4）指示病毒的选择

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指示病毒选择的原则：指示病毒应具有代表性和合理性，可用于正确评价生产工艺的病毒安全性。

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选择指示病毒应考虑的几个方面：

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1）根据生产过程中污染病毒的来源、污染环节和程度、致病性质和特点，以及其它应考虑的各种实际因素，同时结合能够用于评价验证效果的指示病毒的可获得性与相关培养试验条件，尽可能地选择具有一般代表性和特定模拟意义的多种指示病毒。

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2）尽可能选择可培养到高滴度的病毒；并应有可靠、有效的检测方法。

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3）应当考虑指示病毒可能对操作人员形成的健康危害，并采取必要的防护措施；必须注意指示病毒本身的安全性，应遵守国家有关的管理规定，属于烈性传染病毒不能使用。

4）在选择普通指示病毒或/和特定指示病毒时，至少都应当包括RNA和DNA病毒、脂包膜和非脂包膜病毒。

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5）以生物组织原材料或组织原材料匀浆中可能出现的病毒为核心，综合考虑生产工艺、污染病毒及灭活/去除技术方法本身等各方面的特点进行选择。

（5）病毒灭活/去除有效工艺步骤的评价

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首先要有病毒灭活/去除验证的试验资料，并证实在生产工艺过程中某特定步骤能够有效地灭活/去除病毒。对于可能起作用的每个步骤都应进行必要的评价，明确是否具有确切的病毒灭活/去除作用，并确定有效的工艺步骤。在有效的病毒灭活/去除工艺步骤后，不得进行可能引入新污染（如添加动物来源的材料）的操作（除非证明该操作完全排除病毒污染的可能性），严格防止再污染的发生。

一般将病毒感染性滴度减少4log以上的处理步骤认可为有效的病毒灭活/去除工艺步骤。但如果检测方法的最低检测限为103TCID50，即使病毒起始滴度为106TCID50，经处理后未检出病毒，也不宜算作特定的有效工艺步骤，因为处理后病毒的实际滴度有可能大于102TCID50，因此只能根据检测方法的灵敏度表示为未检出。病毒感染量的降低可以从病毒颗粒清除的量或病毒被灭活的情况两方面来评价。可能的情况下，应明确病毒滴度的下降是物理清除还是直接灭活。

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（6）病毒安全性的追踪观察

由于检测方法、监测时间及灵敏性等各种因素的影响，临床前研究中即使动物试验，甚至是灵长类动物试验结果为阴性，也难以完全排除人类感染潜在污染病毒的风险（如潜伏期长的病毒、致病过程缓慢的病毒、感染特异性检测指标未知的病毒等）。因为不同阶段，人们对病毒危害的认识深入程度和全面性等不同，可提供的试验研究支持性资料及侧重点也有所不同；所以对动物来源的生化药物，不论是在临床研究的过程中，还是上市后均应进行必要的病毒安全性追踪观察。

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具体方法：针对可能污染的病毒，注意观察并设立病毒感染的评价指标。包括已知对原材料来源动物有致病性的病毒，在体内、体外试验中能够感染人类组织细胞的病毒，特别是隐性感染的病毒等；通过血清学或培养分离等临床检测，发现和验证在生产过程中未能发现的新病毒及感染特征。采用的检测方法应能够鉴别出人与动物病毒的区别，并经过验证确保方法的敏感性和特异性。在临床研究方案中应有对可疑致病病毒的检测实施方案，包括：急性感染、慢性感染、常规筛查临床隐性感染和血清阳转情况，以及用药前后检测结果的对比。通过主动检测和被动检测及时发现无症状隐性感染患者，避免在人群中可能发生的大规模播散。

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由于许多未知的和不确定因素的存在，最终确定污染病毒的致病性仍需要进行大量的基础研究和临床验证工作，因此，使用动物来源产品的患者，应该知道：经过病毒安全性控制的产品，虽然已经将感染病毒的风险减小到极低的程度，但并不能完全排除这种风险。

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3、脏器生化药物的质量控制要点

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根据脏器生化药物研究的一般过程，其质量控制要点主要分以下三个方面：

1）固定源头（原材料），包括动物的种属、健康状况、饲养环境（封闭饲养）、年龄、采集时间和采集方法等，并制订原材料的质量标准。

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2）研究合适的提取纯化方法，包括动物源性病毒的灭活和验证，确定原液（或半成品）的生产工艺；研究原液（或半成品）中的主要成分、含量、主成分的比例，以及其它成分的控制方法等，制订原液（或半成品）的质量标准。

3）进行制剂的处方工艺研究，制成临床应用的制剂（成品），并进行相应的质量研究，制订成品的质量标准。总之，脏器生化药物质量控制的核心就是全程控制（从源头到终产品，工艺过程控制和质量标准控制）。

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三、生化药物研究应注意的问题

因生化药物的来源复杂，不同的原材料和生产工艺得到的产品的质量会有差异，包括主要成分的含量、比例，以及其它成分的种类和/或含量等，而这些差异往往质量标准反映不出来，从严格意义上说，生化药物没有仿制。所以，在进行生化药物研究时首先要基于“不可仿制”来考虑问题。

1、注重原材料和工艺过程控制，结合质量标准，较全面地控制产品的质量。

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2、产品上市后不要轻易更换原材料、变更生产工艺、改换剂型（尤其是水针、粉针、大输液互换）、延长有效期等。如果需要进行以上变更，应针对变更情况对产品的质量、安全性和有效性的影响（这种影响是指产品的真实质量，并不只是质量标准中的质量控制指标）进行相应的研究工作，包括药学、药理毒理和临床研究。

3、因为生化药物的质量是靠全程控制来保证，其原液（或半成品）应不可以自由销售，否则不仅增大了流通环节再次染菌的可能性，又不利于成品全程的质量控制。

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4、动物源性病毒的灭活工艺及验证是一个需要研发者、审评人员，以及有关方面的专家共同研究和探讨的课题。因为人们对动物源性病毒的认识，以及动物源性病毒与人类感染性疾病的关系的认识是在逐步地深入，对病毒的灭活和工艺验证也会随着人们认识的提高而不断地趋于更科学和合理。

以上简要介绍了生化药物的一般制备方法、工艺过程和质量研究，以及在研究过程中应注意的问题，目的是使研发者进一步了解生化药物的特性和质量控制要点，在进行生化药物研究时重视源头控制和工艺过程控制，建立生化药物全程控制的理念，尤其是在产品上市后，如果补充申请进行某些变更时，需要针对变更对产品的质量、安全性和有效性的影响进行相应的药学、药理毒理和临床研究。

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