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一、方法学验证的目的及意义
1 \) }0 d' G R! z2 |1. 目的：分析方法的验证是为了证明该分析方法与其预期目的相适应。% k& Z o: G. y
2. 需验证的分析方法类型) k9 b7 K# C4 F; R; `$ }
① 鉴别试验
. M$ a# U. V3 N4 B& c② 杂质的定量试验: j7 E. L' ? E% q: {8 Z
③ 杂质控制的限度试验2 W* U) j8 Y! v. Z& O2 S7 H
④ 原料药或制剂中活性成分以及制剂中选定组分的定量试验。
, ~5 A3 J4 J' R/ `; a: T- h试验类型如下：
% |8 U5 O2 u. E$ a2 G% C① 鉴别试验旨在确证样品中的一种被测物的特性。通常将样品的性质（如光谱、色谱行为、化学反应性等） 与参比对照品的性质进行比对。
: d0 {- F) {1 s3 o: ^# ?② 杂质检查是指样品中杂质的定量检测或限度检测，两种检测均是为了准确反映样品的纯度。定量试验所需验证项目与限度试验相比是不同的。( I; f; v0 o. q+ Q8 V: T
③ 含量测定是指测定样品中被分析物的含量。本文件中含量测定是指原料药中主要成分的定量测定。类似的验证项目也适用于制剂中的活性组分或其他指定成分的定量测定，以及与其他分析方法（如溶出度）相关的定量分析。, r" ~7 c- R. d& U8 ?+ p
3. 应清楚了解分析方法的目的，因为这将决定需要评价哪些验证项目。应进行评价的典型的验证项目如下：专属性、检测限、定量限、线性与范围、精密度（进样精密度、重复性、中间精密度）、准确性。8 h, r, Q, ^$ J% p. f# `' J0 h
二、哪些情况需重新验证
# v8 R6 t6 y, G# `. S0 D& G① 原料药合成方法的改变
) o) f0 V7 x# t& Q8 x, F4 ~% K0 ]② 成品组分发生改变
) }2 D% A* b/ D8 J$ N* ?③ 分析方法的改变, S9 Y! c$ v$ B' Q
需要重新验证的程度，应根据改变的情况而定。某些其他的改变可能也要求验证。
# [& O2 v6 j2 W& E2 B- Q' A$ C" M# X2 E9 K
注意：-表示该项目通常不需评价
9 A5 |, M0 ]8 _3 }' { +表示该项目通常需评价4 B) _; D7 _4 G& |
(1) 假如已评价重现性（见术语表），可不需再评价中间精密度；
9 c8 B {$ p5 P9 x9 m; v4 Y(2) 缺乏专属性的分析方法，应由其他分析方法来做补充；' |% e8 p% |3 }9 ?. b( k. X
(3) 有些情况下需要。
8 H2 ^. C0 L% l* n: B- M三、分析方法学验证各项目的定义及其要求
1 R6 W- W E( i- j+ R1. 专属性（Specificity）专属性是指可能存在某些组分(如杂质、降解物、基质等)时，对被分析物准确可靠测定的能力。
4 q0 p- T+ s% o8 C4 u专属性有以下含义：$ t$ N S- [1 R, V) u/ c# P1 ~
① 鉴别：确证被分析物符合其特性。
# ^: p8 u) Q6 ?② 纯度检查：确保采用的分析方法可检出被分析物中杂质的准确含量，如有关物质、重金属、溶剂残留量等。
' g2 a0 k9 U9 [3 Q, e! n4 |$ W③ 含量测定（含量或效价）：提供样品中被分析物的含量或效价的准确结果。
" v6 t0 `6 c7 _1 w' |4 y专属性注意事项：4 J+ R: ~$ z5 O$ P1 q
$ n% H% |9 @# R6 r# F' B: J) _7 ~
+ s0 I6 [ Z3 I5 y8 e" y. p(1) 定位分离试验3 Y4 W+ h; }1 e- _6 d& {& S) O
① 主峰峰纯度的确定9 s4 ^1 |8 ? F
在专属性验证的相关实验中，主成分峰都应该考察峰纯度，确认主成分峰为单一成分的峰。具体做法是用DAD检测器进行峰纯度扫描或者用LC-MS确认没有其他成分。
' B/ V: E" G3 }( p8 \, @. f② 稀释剂
5 p6 u# W# U4 x$ U应考察稀释剂对被测物的干扰，空白稀释剂出的峰应不干扰被测物。具体做法是按照质量标准规定的进样量进样空白稀释剂，记录色谱图。0 h; B- b/ W& o- K) r5 I1 H/ v# a
③ 辅料, t( o4 a4 L" ^
取质量标准规定量的供试品中等量的空白辅料，按照规定分析处理，记录色谱图，空白辅料峰应不干扰被测物。1 z1 `' Y/ Y/ V, u8 F( U( T
④ 有关物质) c: } B6 f% ] a. |- [: a* k& }; r
有关物质分为两大块：工艺杂质和降解杂质。如果在二者均可获得的情况下，将杂质分别定位，并配制一份混合溶液，根据检测内容的不同分别研究。含量测定各杂质峰应不干扰主成分的检测，即各杂质峰应和主成分峰达成基线分离，各杂质峰之间没有要求，重叠也无妨，因为含量测定只需确认主成分峰不受干扰即可。有关物质中各杂质峰和主成分峰之间的分离度均应符合要求，一般不小于1.5。特殊情况可将某些杂质合并控制，如互为对映异构体的非对映异构体，它们在反相色谱法中一般都是重叠的峰。1 z/ j$ q9 ]9 Y- L$ _+ T
如降解杂质不可获得，应进行酸碱氧化破坏条件下考察可能的降解杂质的干扰，该实验一般都做，但不是必须做，如果已经对降解杂质有了充分的研究，就无需做破坏实验。例如已经有了有效期内长期稳定性的研究结果，确认了稳定性期间的实际降解杂质。因为有些情况下，破坏实验的结果不是真实可能的降解杂质，这种情况以双氧水进行氧化破坏最为常见，破坏产物杂乱无章，甚至有可能因为该实验**分析方法。0 x! M+ [! I6 v3 o9 _
(2) 强制降解试验
( U+ Z! t+ M6 x( W3 [$ g, i) k7 [取本品分别在以下条件进行破坏降解试验：" a" O; k$ i( h# U- e# u
图片8 v3 p, D8 h- |* w
注意：酸、碱和双氧水溶液浓度和放置时间均可以根据破坏情况进行调整，如某个条件有降解倾向，应调节条件使破坏至5%-20%之间。如三者均未发现降解倾向，再放置一段时间如10天，依然如此，既可说明本化合物非常稳定，稳定性期间应不会产生降解杂质。$ d# {! e8 ^ Z* o( {
1 Q; U* M2 H" h. A- j$ ?① 峰纯度 A3 d, ^; }2 w$ p
各条件下的峰纯度应符合要求。
/ [0 Y# k( S* z. ]1 z& _ Q6 q# O& o② 分离度
, I* v6 E; Q+ E7 |含量测定方法各破坏产物应与主成分达成基线分离，有关物质方法各破坏产物与主成分之间的分离度均应不小于1.5，各杂质之间的分离度均应不小于1.0。
# x ^$ J. q# w( y" N1 }" e' A③ 质量守恒
z" U( d% b% c有关物质检测方法需要做质量守恒的验算，应评估主成分减少的量与杂质增加的量的一致性。理论上如主成分减少10%，杂质应增加10%，才能说明有关物质方法能准确检出所有的降解杂质。如二者不一致，则证明方法有缺陷，或为降解杂质未检出，或为降解杂质研究不充分，因为没有获得主要降解杂质的对照品，不清楚主要降解杂质的校正因子。
! H* H$ u" B& f5 A④ 质量守恒计算方法3 K, c: q: A7 Z) |+ L6 Q
如主成分峰在线性范围内，可将供试品溶液的主峰峰面积和校正后的总杂质峰面积之和A除以与破坏后的溶液主峰峰面积和校正后的总杂质峰面积之和A破，其限度应在98%-102%之间。即A供/A破的值应在98%-102%之间。制定此限度的依据是药典液相系统适用性实验连续进样5针，允许RSD不大于2%，也即数据2%以内的误差可以归属为仪器引入。" g5 l% U0 Q/ _% _: A0 U
如主成分不在线性范围内，则可测定供试品溶液和破坏后的溶液的主成分含量和有关物质，含量减少值除以有关物质增加值，限度应在90%-110%之间。制定这个依据源自校正因子0.9-1.1之间都可不加校正因子计算有关物质，表明杂质结果允许10%的误差。
0 z% g7 w1 W& V D& |( G以上两个限度非官方规定，为合理限度，仅供参考，实际工作中可根据情况进行调整，本文中涉及的大部分数字都是如此。+ {, n& K- k4 U6 W2 d! b& t5 B; U4 i
⑤ 如何确定哪个降解产物需要进行鉴定？" g' w! o: G# H
建议在每个强制条件下降解的主要降解产物进行鉴定，一个“经验规则”是对超过总降解产物10%的物质进行鉴定，因此，如果药物降解10%，单个降解产物相对主药降解3%，占总降解产物的30%，这个降解产物需鉴定，或者，如果药物降解10%，单个降解产物相对主药降解0.8%，仅占总降解产物的8%，这个降解产物不需鉴定，见PhRMA的“现有指导和最佳实践”等文献，最近PhRMA白皮书文件提出了类似方法作为确定强制降解试验中产生的降解产物进行结构鉴定的算法，该白皮书结合ICHQ3A 和Q3B中的鉴定限给出了强制降解试验中降解产物的鉴定限。见下表：
. j% G) [% G3 h: `/ c; e⑥ 补充说明7 P9 A; r, K( @0 {
降解实验可以有关物质和含量测定同时做，二者可以共用同一份破坏样品，减少工作量，一般来说有关物质的供试品浓度大于含量测定，可以将有关物质破坏后的溶液稀释至含量测定规定浓度。具体如何操作请读者诸君自己设计。
! ~# o k1 Z0 Z- l2. 检测限（Detectionlimit）
9 ~9 c. l& ]4 ~2 x: I3 t, G某一分析方法的检测限度是指样品中的被分析物能够被检测到的最低量，但不一定要准确定量。
. I* I4 \% Q. h! p1 q$ x4 c# k) M检测限注意事项：
9 ]7 [4 T7 L3 g; y; v# P检测限溶液可以由母液稀释直接考察信噪比，在2-4范围内即可。也可由公式LOD=3.3×STEYX/斜率计算得出检测项浓度。
6 y1 M' P. M& b# u( K |3. 定量限（Quantitationlimit）: x1 N# s7 S& M1 t$ n5 t0 v
定量限度是指在合适的准确性和精密度下，能够定量测定样品中被分析物的最低量。它是样品中含量低的化合物定量测定的参数，特别适用于杂质和/或降解产物的测定。
' \ E" R# }4 G3 P1 Y% u' W7 j定量限注意事项：
6 p5 q/ T0 t# N, b }3 I6 e
" D3 q/ Q+ C. m) W' L1 ?* A/ U
! t9 e' e/ l% V+ z& y6 f其测定结果应具有一定的准确度和精密度。从这一概念出发，应确定信噪比为10的供试品的浓度是理所当然的。然而响应情况随着仪器与流动相的不同而不同，在方法验证时所选仪器与流动相得出的信噪比为10的供试品的浓度不具有普遍意义上的代表性，这只是一个偶然值。我们在实际工作中其实无需确定信噪比为10的供试品的浓度，只需证明方法需定量的限度的合理性。以下举例说明：若方法报告限规定为0.05%，那么肯定需要证明此限度能准确定量，如不能准确定量，则此项规定不合理。我们可以稀释制成0.01%的相应溶液，注入仪器检测，其信噪比如大于10，则证明方法有合理的定量限。无需费时费力找出每个杂质的信噪比10的浓度，特别是已知杂质数量较多的情况下，工作量将极为巨大。直接稀释至特定浓度考察信噪比，则非常简单，只需将线性验证项下的混合杂质溶液稀释至目标浓度即可。
$ k- f0 T3 H; H1 N0 [还有一种简单的计算LOQ的方法就是根据线性验证的结果计算，公式为LOQ=10×STEYX/斜率，STEYX为线性数据的剩余标准偏差，可以用EXCEL直接算出这个值。
$ q- D& V( |# G$ n4. 精密度（Precision）6 z' W% }; d: ]" F, B/ l( Y
分析方法的精密度指的是规定条件下对均质样品多次取样进行一系列检测结果的接近程度（离散程度）。精密度可以从三个层次考虑：进样精密度、重复性、中间精密度。分析方法的精密度通常以多次测量结果的变异性、标准偏差或变异系数来表达。
1 ^# Y* X- P# Q' @" D4.1 进样精密度
( X0 X/ k, A/ J: R" u+ B/ b* F主要用来考察仪器进样分析的精密程度。0 v9 {' c3 ]7 b; p+ v8 W* K3 L/ j0 R9 L
进样精密度注意事项：
1 F5 ?, _; J m# E& n3 V( J r0 F; A! i* u/ P+ p0 c
4.2 重复性（Repeatability）; z& [' S. y. n
重复性是指在同样的操作条件下，在较短时间间隔的精密度：也称为批内精密度（Intra-assayprecision）。" A" l. X4 C# i1 D7 _
重复性注意事项：% Z- ?7 F# J8 _$ V' Z7 o
" |& n2 B# P% w8 K+ g- |4.3 中间精密度（Intermediate precision）, O8 Z' v j$ u" e3 q
中间精密度是指试验室内部条件改变，如：不同日、不同分析者、不同仪器等情况下的精密度。1 o& [. w5 [5 o, j' b6 Y
中间精密度注意事项：
; C' F8 N# K) f- Y吧
* z( d/ j- f! m4 l0 w* n& M* E; O; P 6 A% F6 \2 `, U; j) e
5. 线性与范围（Linearity and Range）* I$ r7 _8 c/ G5 _
分析方法的线性是指在给定的范围内检测结果与样品中被分析物的浓度（量）成比例关系的能力。分析方法的范围是指样品中被分析物的较高浓度（量）和较低浓度（量）之间的一个区间，并已证实在此区间内，该方法具有合适的准确性、精密度和线性。
. t( w0 s' V# @8 h9 C; b* R线性与范围注意事项：: j2 W2 A9 F4 z5 n$ k5 M1 B; {
1 M+ v! T/ J0 B
需要注意的是在有关物质线性验证中，除面积归一法之外，范围不宜太宽，否则相关系数较差，截距较大。如果波长较小，接近流动相截止波长，则流动相本底吸收较大，则更要缩小线性验证的范围。每个点峰面积为供试品实际的响应值减去流动相本底值。日常工作中应该能发现在高流动相本底吸收的低浓度下响应远小于高浓度响应除以相应稀释倍数的值，就是由于流动相本底的影响。一般有关物质线性范围可以是限度的20%、50%、80%、100%、120%、150%。还需注意的是线性范围应包括准确度的三个值。7 m- a$ M, K- \# ~% _. D, a9 D
6. 准确度（Accuracy）
# f8 @1 d2 w5 b& {' v' o/ {分析方法的准确性指的是真实值或认可的参考值与测量值之间相近程度。准确性有时也称真实度。 g1 k4 q! b; e/ ?+ H( R$ d
准确度注意事项：, f* A8 X2 e5 D; @
吧" S* @2 S2 r* p+ ?( B) h7 [
5 y1 _' F8 j7 ]. ]. }
有关物质准确度的数据应该按照质量标准规定处理，例如质量标准规定为加校正因子的自身对照法，则应该按照质量标准的规定计算各样品溶液的杂质含量，并计算回收率。偶见用外标法计算有关物质的回收率，而质量标准规定的是自身对照法。这背离了方法验证的本意，方法验证应该验证方法自身的准确度。如果用外标法回收率合格，但线性验证出现问题，校正因子计算不准确，导致实际工作中检测结果偏离真实值，而方法验证却判断符合要求，这明显是不合理的。
. f: y" K. i' ]) E% |7. 耐用性（Robustness） f! X, Q8 t9 N" V$ I1 i
分析方法的耐用性是指在试验参数被故意地发生细小改变时，检测不受影响的能力，用于说明正常使用时的可靠性。/ P, y5 ]; g* n( i: L2 `
(1) USP中关于耐用性试验考察的条件及范围( K2 r/ c) ~' O7 K
① 等度条件8 _0 B$ B3 b3 a6 {% A Y' w! L# X
9 k: {6 ]- x a: l
② 梯度条件
" ~" L4 v* b' d# c9 [9 J$ A* _+ z+ s3 Y% z
(2) EP中关于耐用性试验考察的条件及范围
& n9 ]! ~7 X) s① 等度条件" C% F/ C5 \+ h8 a, r
/ Z- Z# w3 O. x5 Y" j/ ]& t' T
7 C& O% I P% t# L# [8 e5 I② 梯度条件
; j9 Q1 b7 I$ t+ v) i$ A2 ]( b! ?( \5 y
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