骗局4:UPLC不能使用整体柱、严重牺牲LC基本性能,高压下存在耐用性差等问题
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原帖:
以下为部分文章:
9 b# Y! O: U7 }; q. {, j( A作为快速LC的特征,还有峰的响应性快.为追随快速地出峰,必须提高LC系统的响应性,但提高响应性则噪声增大.有关Waters的UPLC的灵敏度,宣传「与一般粒径5μm色谱柱相比,灵敏度提高3倍」,但未触及S/N比.这是因为灵敏度虽然提高了,但噪声也增大了,所以不能说S/N比. Agilent的1200系统,为提高LC系统的响应性,推荐从流路拆除送液泵的阻尼器和混合器.但是,拆除送液泵的阻尼器和混合器时,就会发生基线噪声增大或混合不充分的梯度结果. Agilent的1200系统缩短了检测池的光程.通过缩短光程可降低噪声,但信号强度的下降的更多,因此,其结果引起S/N比的下降.如上所述,高压LC牺牲了一般LC应有的基本性能.6 N& q; M' l5 \; w
比如,自动进样器中的六通阀是要求具有坚固性的部件.8 k; {1 c6 y* ~
一般,六通阀的耐久性能依存于技术规格上所规定的最大压力.并且,采用同样转子密封材质的六通阀,技术规格上的最大压力越高,维护频率增加.- [9 ]! x3 [: U1 V! N F; L# X
转子密封的寿命(耐磨损性能)取决于六通阀制作时的闭紧压力,而不取决于分析时的送液压力.这是因为,无论是否进行流动相送液,在阀制作时调整的闭紧压力一直加载在转子密封上.为此,即使在低压下连续使用高压LC,寿命也不会延长.并且,装置的耐久性低则维护频率增加 ―― 高压LC时,用户难以自己进行维护,甚至消耗品的替换也需依赖于厂家.
3 `3 O6 p' A5 n* o6 R于是,修理等待天数以及修理期变长,等待用户的是「以实现分析工作快速化为目的引进装置,装置不能运转的天数却增加了」这样讽刺的结果.并且,发生了以往本来不需要的维护费用. f H: `1 l4 ~- H6 C9 v9 G9 H
Agilent1200系统,耐压为60 MPa (600kgf/cm2),六通阀的维护频率与Waters的UPLC差不多 ―― Agilent的1200系统以及Waters的UPLC,六通阀的寿命都只有5,000次分析.
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开始辟谣:
原帖说到了三件事:牺牲信噪比;高使用维护成本;以及无法使用整体柱(这项在原帖当中没具体说明,但是在度娘的原文里确实有详细解说)
1 ^7 d$ n* j t: {辟谣开始:
信噪比确实是衡量灵敏度的硬指标,而且确实受到检测器基线噪音的影响,而检测器的基线噪音确实随着检测器采样速率的提高而提高,这些原帖用于攻击UHPLC技术的理论基础都是没错的,但可是,可但是,技术是在进步,现在的UHPLC系统所用到的检测器的噪音控制能力都以及比以往的HPLC系统有了很大的进步,能够保证即使在很高的采样速率下也能保证很低的噪音水平,这个大家只要看一看各家仪器的指标和验收参数就可以知道了。
1 z0 x4 q, q0 J) n接下来,从技术层面来讲采样速率对UHPLC的影响,这一部分也可以让大家明白一些UHPLC方法中检测器参数设置的原因:
首先,要解释我们看到的色谱图是怎么来的,当然是被检测器检测到的,不过,这个检测并不是样品分析结果真正的样子,而是检测器看到的样子,而检测器的采样频率,决定了到底可以把样品分析的结果看得“多清楚”
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举个例子,比如两个人比武,如果对手是个街头混混,只会点三脚猫的功夫,那么过起招来,他的路数可以被看个一清二楚,见招拆招,可以赢得很轻松;如果对手是个武林高手,比如小李飞刀,根本看不到他出招,脖子上就已经挨了一刀,那就完蛋了。所以说,采样速率决定了仪器的武功能不能跟上对手(分析方法)的动作,HPLC的分离速度大概和江湖混混差不多,而UHPLC的出手基本上就是小李飞刀了。
, x7 X$ `6 @# i9 J既然知道了速度的重要性,到底多好的眼里才能跟上小李探花的速度呢?通常来讲,如果要准确描绘一个色谱峰,至少要保证在这个峰上采集到15~20个数据点,在HPLC分析中,一个色谱峰的宽度通常大概都是30~60秒,对于检测器来说,即使采用1Hz(每秒采集一个数据点)的采集速率,也可以收集到足够的数据点;但是对于UHPLC方法,色谱峰的峰宽普遍通常都在3~6秒,大多数情况下,超过10秒的峰宽已经算是奇葩一样的存在了,这样一来,1Hz的采样速率就远远不够了,所以我们就得提高采样速率。但是采样速率的提高又不能无限制的一直来,因为采样速率高了,基线噪音就要变大,所以提高采样速率的原则是:够用就好。
* k6 @3 L1 _; {* k5 V/ ^8 a接下来,原文中还提到了为了减小延迟而减小混合体积从而导致基线噪音增加的问题,延迟体积的大小直接决定了梯度延迟时间的长短以及色谱柱在重新回到平衡状态时所需要的时间,而所有的的液相色谱产品,混合器的体积都是延迟体积的一部分,混合器的大小直接决定了溶剂混合的效能,这个混合效能又会直接影响到紫外类检测器的基线噪音水平,特别注意,是紫外类检测器
0 H, m' y2 E# F对于延迟体积,混合效能,分析速度和噪音水平这些事情,我们必须要知道的是:如果能把左右的项目都做到最好,要付出非常大的代价(这个大家可以去比较一下各家厂商顶级的UHPLC产品和入门级的UHPLC产品的价格就能明白了),所以,如何根据自己的真正使用状况选择最合适的UHPLC产品达到最好的性价比,才是更好的对待UHPLC的态度:
比如我们的实验室经常使用的是4.6mm内径的色谱柱用1mL/min的流速进行分析,那么一台延迟体积是500uL的仪器,它真正对方法造成的延迟时间是半分钟;但是如果我们使用2.1mm内径色谱柱用0.2mL/min的仪器进行分析,如果仍旧要求延迟时间是半分钟,那么仪器的延迟体就就要减小到100uL,这样就要改变仪器的流路设计,比如减小混合体积。这时候,原帖中的观点似乎起到作用了,混合体积小了,紫外基线噪音变大,但是,通常我们大部分时候都是在连接质谱检测器的时候才使用到这么细的色谱柱以及如此低的流速,而质谱检测器的基线噪音水品对流动相的混合充分与否是非常不敏感的。
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所以,我们可以看出,对于仪器的选择和使用,只要我们考虑到我们使用的实际情况,结合仪器的特点,并不会出现原帖中所说的分析效果变差的情况。当然,随着UHPLC技术的普及,大家越来越多的考虑在搭配紫外类检测器的UHPLC系统上使用小内经色谱柱,这样就会对仪器的延迟,扩散还有检测器的采样速率及噪音控制能力有很大挑战了,当然,现在各个厂商的高端UHPLC产品,还是可以很轻易的满足这些要求的。
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讲过噪音的产生,我们还要看看信噪比的另一个关键——信号,噪音越大,信噪比越差,灵敏度越低,不过,原帖中似乎忽略了UHPLC对于信号的提高:如果我们把色谱峰近似的认为是一个三角形的话,我们可以很容易发现:相同量的样品进入色谱柱,峰面积是一样的,但是,峰底宽越小,峰的高度会越高,因为三角形面积是正比于底边长和高的,面积固定,底边越小,峰高越大,这就意味着峰越“瘦”,它的峰高就会越大。
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在UHPLC方法分析得到的峰通常都会比HPLC方法中瘦的多,因为物质在色谱柱上是受到“聚集”和“扩散”两个因素作用的,扩散和聚集,就像是跑步机和大盘鸡,永远是矛盾的存在…
“聚集”作用让相同物质尽量聚集在一起,是让峰变瘦的力量,这股力量,主要和柱效有关;而“扩散”作用,是和“聚集”相对的,是让峰变胖的因素,这个因素和物质在色谱柱内停留的时间有关系;在之前我们讨论过,要达到相同的柱效,UHPLC可以使用更短的色谱柱,而分析的时间又正比于色谱柱的长度,意味着,在聚集效果相同的情况下,UHPLC模式下的扩散更小,所以峰就更瘦,从而导致峰高更高,这就像是有些天生拉仇恨的人,光吃大盘鸡,不上跑步机,可还是瘦成一道闪电…可有些人,喝口凉水都要长肉…
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废了好多话,刚说完灵敏度一件事儿,我们接下来还要说下运行和维护成本的事情:
首先,是使用寿命,尤其是原帖中提到的六通阀的使用寿命,虽然可能耐高压的阀的购买和维修成本是要比普通阀高一些,但是他们的使用寿命是一样的,并不存在人类社会里的“压力大死的快”的过劳死现象
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从我个人的使用经验来看,UHPLC比HPLC使用成本高的一个主要原因在于样品处理的要求,因为HPLC的样品过滤通常使用到的是0.45um的滤膜,而UHPLC则要求使用0.22um的滤膜,这个成本上有点差异,其他的至于维修和配件,绝大部分并不存在UHPLC显著高于HPLC的现象,只要仪器使用维护得当,整体的维护成本并不会比HPLC高特别多,这就是像是平时注意养生保健,就不至于总要到医院去看病的道理一样。
) N( E) k3 M" ?8 Y3 B既然说到成本,再多说一句,从长期的角度来看,UHPLC可以更有效的降低实验室的整体运行成本,主要是由于UHPLC节省了很多流动相:UHPLC通常可以用1/3长度的色谱柱取代原来的HPLC色谱柱,从而将分析时间和单个样品的溶剂消耗降为原来的1/3,在加上现在大家越来越多的使用性价比更好的3.0mm内径的色谱柱(相同分析速度仅需原来2/5的体积流速),又可以进一步降低溶剂的消耗,这样下来,单个样品运行的溶剂消耗会比原来节省近10倍,按照这个比例,大家可以计算一下一台仪器的使用寿命内,UHPLC到底可以比HPLC节省出多少溶剂,如果算上时间节省的成本,买台UHPLC还是非常值得的。
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最后,关于整体柱,其实,UHPLC仪器并不对色谱柱的种类有要求,只要接口合适,柱温箱里放得下,任何色谱柱都可以接到UHPLC的系统上使用。整体柱,其实是一种新兴的色谱柱制造技术,使用了整体烧结的柱床取代了传统的颗粒填充柱床,它的优势在于具有类似UHPLC色谱柱的柱效,而压力几乎和HPLC色谱出差不多,这看起来,好像解决了所有问题,不过,大家有多少人用过整体柱呢?
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很少吧,为什么呢?因为市面上能见到的商品化的整体柱太少了,比起全多孔硅胶技术的UHPLC色谱柱来说,可以说是凤毛麟角般的稀有。大家一定会问,为啥这么好的东西没人生产?这是因为,整体柱虽有千般好,但是有个致命的弱点至今还无法结局,从而限制了它的发展:这货的批间重现性太差…这跟这种色谱柱的制作工艺有关系,它的柱床是采用烧结技术制造的,在烧结过程中,很难控制所有参数的完全重现,即使是参数完全重现,也很难保证每批次间产品的性能完全一致,就像烤面包,即使保证了烤箱温度和烘烤时间一样,我们也不太能保证在发面和装盘的时候完全一样,因为这些因素是无法认为控制的。但是面包烤软点硬点都能吃,不过,作为一根色谱柱,问题可就大了,没人会希望看到换了个批号的色谱柱之后相同物质的保留时间漂上几分钟…由于这个软肋,整体柱的使用还是受到了极大的限制,这和使用什么仪器是没有半点关系的…
: i$ A" q$ j1 A4 \”骗局五“的辟谣:关于液质联用2014-10-08 [url=]液相达人馆[/url]. a/ A/ S! r2 Z* ]3 P0 e# ?
. Q9 C2 E) \$ D! v$ p骗局5:高压LC的问题:无论作为MS前端装置的LC还是作为一般的LC都不合格
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2 w8 p' y" c9 L9 ?1 S& X只要不解决「交叉污染大」的问题,即使可以进行快速分析,也没有资格作为MS前端装置的LC ―― 这是因为越是像MS这样的高灵敏度,就越不能忽视交叉污染的影响.
% X1 Q4 U0 u' W4 l; g并且,只要不解决「进样重现性差」,「分离不充分」,或「得不到充分的S/N比」等问题点,即使可以进行快速分析,作为一般的LC也是没有资格的―― 按照已有的LC合格的试验法进行分析时,因装置性能低,有可能变为不合格.8 n" Z& [' |5 o! ~3 x& t
Waters和Agilent宣传UPLC和1200系统这样的高压LC「可用于一般的LC分析」,但在这种言辞背后隐藏了「但是,不能得到一般LC的基本性能」的事实.
; @) k% G5 t, X5 \; }( ^这样,Waters、Agilent的姿态是,为了实现快速化,「基本性能即使与日立、日本分光等厂家的一般LC一样也没关系」.
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开始辟谣:
针对最后的一点,可以说已经无力吐槽了,原帖只是把前面四个谣言里的观点做了一个总结性的的发言,只不过是把矛盾的焦点集中在了质谱联用的匹配性上,以吸引大家的眼球,大有“彻底堵死UHPLC的最后一条路”的气势。
: E" m8 u& G9 o* |9 L: K4 L0 ~除了已经在之前讨论过的关于分离度,灵敏度等等的辟谣之外,这里出现了另外的两个指标:交叉污染和进样重现性。
) C; ^1 {4 U/ ^# f对于分离度方面,没有任何一家仪器厂商否认过液相分离对于质谱分析的重要性,而且所有UHPLC厂商的设计初衷也是在不损失或尽量提高分离效果的同时提高分析速度为前提的。
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有关信噪比,之前我们已经说过,质谱检测器对于由于混合带来的基线噪音并不敏感,反而会随由于峰变瘦带来的峰高变高而变高。
Z5 d! @% c. f2 z% h, @9 }接下来是交叉污染和进样重现性的问题,无论是在HPLC年代还是在UHPLC年代,这两个参数对质谱检测器都很重要,而且在UHPLC年代由于仪器设计的更新,这两方面的表现反而还要比HPLC年代的仪器表现更好:
( c/ E- ~# t: H) R" b) X, }交叉污染的干扰主要体现在是否能被检测器检测到,检测到了之后是否干扰定量分析的结果,在较差污染率相同的情况下,前者和检测器的灵敏度有关,后者和方法学要求有关。通常各个厂家用于连接质谱的自动进样器的交叉污染指标都已经可以达到万分之几的水平(这已经远远好于老型号的HPLC仪器),如果再配合上合理的方法设置,这个水平还可以更低,对于现有质谱的灵敏度或者方法学的要求,这已经足够了,并不存在UHPLC比HPLC退化的说法。
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关于进样重现性的问题,UHPLC确实比HPLC遇到更多挑战,这个挑战主要来自于小体积进样时的精准度,因为之前我们已经讨论过,UHPLC使用的色谱柱柱体积通常比HPLC更小,所以相应的进样量也会更小,通常在UHPLC方法中很少会见到进样量大于10uL的方法,如何保证在如此小的进样体积下的精密度,这是个挑战,所幸的是,现在的UHPLC仪器系统已经很好的解决了这个问题,自动进样器重复进样的峰面积RSD都可以控制在1%以内,这个数值已经完全能够满足任何方法学所需要的精度要求了,反而是质谱检测器本身由于离子化效率,离子传输稳定性以及采样速率等问题带来的峰面积重现性反而成了结果误差的主要来源,当然,随着技术的进步,现在的质谱检测器在这些方面也已经有个长足的进步,UHPLC/MS的的方法学考察,要把峰面积的RSD做到2%以内也并不是什么难事了。
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最后,辟谣五条之后,做一个简单的小结吧:
UHPLC技术并不仅仅是像看上去的那样“仅仅是压力提升”那样简单的升级,这个升级的过程就像是从固定电话到手机的变化,不仅仅是把线剪断那么容易,之中涉及的细节和技术原理十分复杂。
大家对UHPLC技术的恐惧很多情况下是来自于高系统压力带来的紧张,担心方法的稳定性,仪器的耐用性等等,这种恐惧很像是大家从坐绿皮火车到改坐高铁动车一样,只要做好仪器的使用维护,做好样品的处理,大家会发现压力和速度并不会让方法的稳定性变差
还有是关于一些“UHPLC不如想象的那样好”或者“UHPLC好像还不如HPLC好用”的问题,初次接触UHPLC,总可能遇到一些打击自己的问题,比如分离度表现不理想,色谱柱耐用性差等等,这些时候,就是要注意细节的地方了,比如做方法转换的时候是否注意到了色谱柱的选择性,检测器是否根据UHPLC方法的速度适当提高的采样速率等等,只要注意了相应的细节,相信大家都可以把UHPLC使好的。
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最后的最后,如果大家能有耐心看完这些的话,我还想说下我对谣言的看法:
谣言的产生,源于大家对某些事物的不了解;
谣言的传播,源自大家对这些事物了解的渠道闭塞;
如果想破除谣言,就要有抽丝剥茧探明真相的态度,对于科学技术,其实真相很清楚,有时只是大家被谣言迷惑了视听,这一层假象的面纱,其实很容易被揭穿的。
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