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; F* i7 R; w! M$ N+ ?+ ~8 _: z' | b. kHPLC谱图异常问题与原因及解决方法..PDf: L+ J, c% K4 ]0 }$ i U
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液相色谱系统的许多问题都可以在谱图上反映出来。其中有一些问题可以通过改变设备参数得到解决;而其他的问题必须通过修改操作程序来解决。对于色谱柱和流动相的正确选择是得到好的色谱图的关键所在。 - C9 \% S6 H K- G R& w. t) d+ T' D' l
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: x' a4 B* |9 m2 p" c& A4 zA、峰拖尾
h" q3 i) Z9 D& B9 f原因 | 解决办法 | 1、筛板阻塞 | 1、a、反冲色谱柱 b、更换进口筛板 c、更换色谱柱 | 2、色谱柱塌陷 | 2、填充色谱柱 | 3、干扰峰 | 3、a、使用更长的色谱柱 b、改变流动相或更换色谱柱 | 4、流动相PH选择错误 | 4、调整PH值。对于碱性化合物,低PH值更有利于得到对称峰。 | 5、样品与填料表面的溶化点发生反应 | 5、a、加入离子对试剂或碱性挥发性修饰剂 b、更改色谱柱 | / Y& k1 f& u. u
B、峰前延& H. k3 j5 r6 x# t9 k9 l- k
原因 | 解决办法 | 1、柱温低 | 1、升高柱温 | 2、样品溶剂选择不恰当 | 2、使用流动相作为样品溶剂 | 3、样品过载 | 3、降低样品含量 | 4、色谱柱损坏 | 4、见A1、A2 |
" A! D# u7 u$ \2 S5 O& g/ {( kC、峰分叉
+ c; W4 m" X4 D9 v0 C原因 | 解决办法 | 1、保护柱或分析柱污染 | 1、取下保护柱再进行分析。如果必要更换保护柱。如果分析柱阻塞,拆下来清洗。如果问题仍然存在,可能是柱子被强保留物质污染,运用适当的再生措施。如果问题仍然存在,入口可能被阻塞,更换筛板或更换色谱柱。 | 2、样品溶剂不溶于流动相 | 2、改变样品溶剂。如果可能采取流动相作为样品溶剂。 | - l F- N7 g; G/ m% {& ~
D、峰变形
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$ j2 c6 X1 E. K. bE、早出的峰变形 / n- r% B- E, W, K
原因 | 解决办法 | 1、样品溶剂选择不恰当 | 1、a、减少进样体积 b、运用低极性样品溶剂 | 2 L. ^8 h3 M! y- Y6 N
F、早出的峰拖尾程度大于晚出的峰
/ M0 q% A( C% n: b原因 | 解决办法 | 1、柱外效应 | 1、a、调整系统连接(使用更短、内径更小的管路) b、使用小体积的流通池 |
8 h+ [, A4 @! ?/ g5 W/ \. gG、K’增加时,脱尾更严重
* G# i! P. h5 H, ^+ i3 o7 p原因 | 解决办法 | 1、二级保留效应,反相模式 | 1、a、加入三乙胺(或碱性样品) b、加入乙酸(或酸性样品) c、加入盐或缓冲剂(或离子化样品) d、更换一支柱子 | 2、二级保留效应,正相模式 | 2、a、加入三乙胺(或碱性样品) b、加入乙酸(或酸性样品) c、加入水(或多官能团化合物) d、试用另一种方法 | 3、二级保留效应,离子对 | 3、加入三乙胺(或碱性样品) | 8 J+ u+ a. b/ V' B _# T8 i
H、酸性或碱性化合物的峰拖尾
. D5 P2 i3 B ]# a' `原因 | 解决办法 | 1、缓冲不合适 | 1、a、使用浓度50-100mM的缓冲液 b、使用Pka等于流动相PH值的缓冲液 | 7 h9 }1 ~8 R/ d% Y
I、额外的峰
S- w( h6 [; h$ w原因 | 解决办法 | 1、样品中有其他组份 | 1、正常 | 2、前一次进样的洗脱峰 | 2、a、增加运行时间或梯度斜率 b、提高流速 | 3、空位或鬼峰 | 3、a、检查流动相是否纯净 b、使用流动相作为样品溶剂 c、减少进样体积 |
/ v i% ? s% E1 g5 MJ、保留时间波动 1 G) F- h% {1 q
原因 | 解决办法 | 1、温控不当 | 1、调好柱温 | 2、流动相组分变化 | 2、防止变化(蒸发、反应等) | 3、色谱柱没有平衡 | 3、在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱 |
$ p- L4 F V1 m0 o' VK、保留时间不断变化 " V! ?. K- Z" ]
原因 | 解决办法 | 1、流速变化 | 1、重新设定流速 | 2、泵中有气泡 | 2、从泵中除去气泡 | 3、流动相选择不恰当 | 3、a、更换合适的流动相 b、选择合适的混合流动相 | & |) i6 I7 ?! E9 \ [/ |
L、基线漂移
' k6 s3 N I/ `" f5 x原因 | 解决办法 | 1、柱温波动。(即使是很小的温度变化都会引起基线的波动。通常影响示差检测器、电导检测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。) | 1、控制好柱子和流动相的温度,在检测器之前使用热交换器 ' W+ @% i0 a4 p: }4 y
| 2、流动相不均匀。(流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移。) | 2、使用HPLC级的溶剂,高纯度的盐和添加剂。流动相在使用前进行脱气,使用中使用氦气。 | 3、流通池被污染或有气体 | 3、用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池。如有需要,可以用1N的硝酸。(不要用盐酸) | 4、检测器出口阻塞。(高压造成流通池窗口破裂,产生噪音基线) | 4、取出阻塞物或更换管子。参考检测器手册更换流通池窗。 | 5、流动相配比不当或流速变化 | 5、更改配比或流速。为避免这个问题可定期检查流动相组成及流速。 | 6、柱平衡慢,特别是流动相发生变化时 | 6、用中等强度的溶剂进行冲洗,更改流动相时,在分析前用10-20倍体积的新流动相对柱子进行冲洗。 | 7、流动相污染、变质或由低品质溶剂配成 | 7、检查流动相的组成。使用高品质的化学试剂及HPLC级的溶剂 | 8、样品中有强保留的物质(高K’值)以馒头峰样被洗脱出,从而表现出一个逐步升高的基线。 | 8、使用保护柱,如有必要,在进样之间或在分析过程中,定期用强溶剂冲洗柱子。 | 9、使用循环溶剂,但检测器未调整。 | 9、重新设定基线。当检测器动力学范围发生变化时,使用新的流动相。 | 10、检测器没有设定在最大吸收波长处。 | 10、将波长调整至最大吸收波长处 |
: v E% N( T6 KM、基线噪音(规则的)
8 |5 K% U2 _, T7 ~/ z- S$ ~7 A6 L原因 | 解决办法 | 1、在流动相、检测器或泵中有空气 | 1、流动相脱气。冲洗系统以除去检测器或泵中的空气。 | 2、漏液 | 2、见第三部分。检查管路接头是否松动,泵是否漏液,是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要,更换泵密封。 | 3、流动相混合不完全 | 3、用手摇动使混合均匀或使用低粘度的溶剂 | 4、温度影响(柱温过高,检测器未加热) | 4、减少差异或加上热交换器 | 5、在同一条线上有其他电子设备 | 5、断开LC、检测器和记录仪,检查干扰是否来自于外部,加以更正。 | 6、泵振动 | 6、在系统中加入脉冲阻尼器 |
. q1 S! Y1 y4 `( l j; W+ k4 KN、基线噪音(不规则的) % ~: s; }$ y" }8 m3 P! b# v2 \
原因 | 解决办法 | 1、漏液 | 1、见第三部分。检查接头是否松动,泵是否漏液,是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要,更换密封。检查流通池是否漏液。 | 2、流动相污染、变质或由低质溶剂配成 | 2、检查流动相的组成。 | 3、流动相各溶剂不相溶 | 3、选择互溶的流动相 | 4、检测器/记录仪电子元件的问题 | 4、断开检测器和记录仪的电源,检查并更正。 | 5、系统内有气泡 | 5、用强极性溶液清洗系统 | 6、检测器内有气泡 | 6、清洗检测器,在检测器后面安装背景压力调节器 | 7、流通池污染(即使是极少的污染物也会产生噪音。) | 7、用1N的硝酸(不能用磷酸)清洗流通池 | 8、检测器灯能量不足 | 8、更换灯 | 9、色谱柱填料流失或阻塞 | 9、更换色谱柱 | 10、流动相混合不均匀或混合器工作不正常 | 10、维修或更换混合器,在流动相不走梯度时,建议不使用泵的混合装置 |
. d7 P! `/ ^# y$ ZO、宽峰
. j6 J) {! y, _7 r0 _; ? {! C3 V原因 | 解决办法 | 1、流动相组成变化 | 1、重新制备新的流动相 | 2、流动相流速太低 | 2、调节流速 | 3、漏液(特别是在柱子和检测器之间) | 3、见section 3。检查接头是否松动、泵是否漏液、是否有盐析出以及不正常的噪音。如果必要更换密封。 | 4、检测器设定不正确 | 4、调整设定 | 5、柱外效应影响 a、柱子过载 b、检测器对反应时间或池体积响应过大 c、柱子与检测器之间的管路太长或管路内径太大 d、记录仪响应时间太长 | 5、 a、小体积进样(例如:10ul而不是100ul)以1:10或1:100的比例稀释样品 b、减少响应时间或使用更小的流通池 c、使用内径为0.007-0.01的短管路 d、减少响应时间 | 6、缓冲液浓度太低 | 6、增加浓度 | 7、保护柱污染或失效 | 7、更换保护柱 | 8、色谱柱污染或失效,塔板数较低 | 8、更换同样类型的色谱柱。如果新柱子可以提供对称的色谱峰,则用强溶剂冲洗旧柱子。 | 9、柱入口塌陷 | 9、打开柱入口,填补塌陷或更换柱子 | 10、呈现两个或多个未被完全分离的物质的峰 | 10、选择其它类型的色谱柱以改善分离效果 | 11、柱温过低 | 11、提高柱温。除非特殊情况,温度不宜超过75℃ | 12、检测器时间常数太大 | 12、使用较小的时间常数 |
# P( L$ n8 H- j: ~9 {. J' tP、分离度降低 4 b) J/ G8 s( e/ @+ A8 [
原因 | 解决办法 | 1、流动相污染或变质(引起保留时间变化) | 1、重新配置流动相 | 2、保护柱或分析柱阻塞 | 2、去掉保护柱进行分析。如果必要则更换保护柱。如果分析柱阻塞,可进行反冲。如果问题仍然存在色谱柱可能被强保留的污染物损坏,建议使用恰当的再生程序。如果问题仍然存在,进口可能阻塞了,更换入口处的筛板或更换色谱柱。 | 3 Q) X: W5 e6 m# k0 D5 J
Q、所有的峰面积都太小
$ P: \- K9 E O' h0 }原因 | 解决办法 | 1、检测器衰减设定过高 | 1、减少衰减的设定 | 2、检测器时间常数设定太大 | 2、设定较小的时间常数 | 3、进样量太少 | 3、增大进样量 | 4、记录仪连接不当 | 4、使用正确的连接 | 5 d) ^1 T2 K% v0 _$ P
R、所有的峰面积都太大
^7 l" N% t- K, K- {& r原因 | 解决办法 | 1、检测器衰减设定过低 | 1、采取较大的衰减 | 2、进样过多 | 2、减少进样量 | 3、记录仪连接不正确 | 3、正确连接记录仪
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液相色谱柱的选择及维护150713
d0 Y- Q/ Y7 p液相及液质分析方法学的开发及验证.PDF(网盘分享)
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高效液相色谱各类疑难问题解答整理汇总
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6 C5 G& q+ f) B8 b* [ P【色谱技术丛书】高效液相色谱方法及应用(第二版)于世林主编
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