2020版药典解读四-生物毒素类污染残留的操作与变化

2020版药典解读四-生物毒素类污染残留的操作与变化

分析工作者

随着国家对生物毒素类污染残留的监管力度加大，各级实验室都面临着尽快建立切实可行的检测方法，普瑞邦(Pribolab)特组织技术人员认真研读食品、粮油、饲料（以及宠物食品）及中药等行业真菌毒素检测国家标准以及国家食品污染和有害因素风险监测要求，并在此就2020版药典《中国药典》编写了《中药材中黄曲霉毒素分析方法解决方案》，供中药材检测实验室人员参考查询。
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( ]) @" R5 X) Q& j9 C* G. G普瑞邦自成立以来，始终坚持诚信、协作、创新、发展的价值观，肩负立足创新，以优质产品赋检测于精准，以创新技术推进检测技术进步的使命，专注于真菌毒素检测技术与产品服务。继2017年全自动免疫亲和柱操作仪推出之后，2018年年初普瑞邦（青岛）技术中心在国内率先推出拥有自主知识产权的展青霉素、呕吐毒素、环匹阿尼酸、黄曲霉素等一系列13C稳定同位素内标，成为全球第二家拥有自主研发生产真菌毒素13C稳定同位素内标的供应商。产品线涵盖真菌毒素固/液标准品、13C稳定同位素内标、质控样品、前处理净化柱(多功能净化柱和免疫亲和柱、分子印迹柱) 、酶联免疫试剂盒、检测卡以及样品前处理自动化仪器（全自动免疫亲和柱操作仪、自动化均质器、自动配标仪），光/电化学类衍生器等设备。也提供维生素、抗生素、过敏原检测、转基因检测和食品酶法分析试剂盒等多类产品。
我们不仅承诺为您提供质量可靠、稳定优质的色谱耗材和仪器，同时保证售前、售中和售后完备的产品技术服务。

$ ]) k' o) W* G如您工作中涉及实验方法开发、色谱条件优化、产品选择、使用方法指导等问题请拨打免费服务热线13311409196。
   
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+ v6 l5 F" T) G' |8 }; W7 d, F& M一、 2020版药典2351黄曲霉毒素测定法
二、 2020版药典相比2015版药典检测黄曲霉方法变化解读
三、 SN/T 4604-2016进出口中药材中真菌毒素的测定（节选）
& Q- m, z6 e5 o四、 复杂中药材样品测定解决方案
五、 Auto IPS-6060 全自动免疫亲和操作仪应用于药典中黄曲霉毒素测定
六、 中药材黄曲霉毒素测定采购指南
% ]/ g7 o7 |* P, C七、 中药材黄曲霉毒素测定常见问题举例

一、2020版药典2351黄曲霉毒素测定法

第一法 液相色谱法
! `% k' N; L4 ^/ [本法系用高效液相色谱法（通则0512）测定药材、饮片及制剂中的黄曲霉毒素（以黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2总量计），除另有规定外，按下列方法测定。
（一）色谱条件与系统适用性试验
( K  |/ K1 V9 `, @7 b1. 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂
; |: [0 B, ~2 J: u0 W" ]) s& h2. 流动相：甲醇-乙腈-水（40:18:42）
3 W1 H' o  x6 J0 T- d3. 采用柱后衍生器检测
4. ①碘衍生法：衍生溶液为0.05%的溶液(取0.5g，加入甲醇100mL溶解，用水稀释至1000mL制成），衍生化泵流速0.3mL/min，衍生化温度70℃；②光化学柱后衍生器（254nm.PriboFast-KRC光化学柱后衍生器.Pribolab-MDU光化学柱后衍生器）
5. 荧光检测器检测，激发波长：360nm(365nm) 发射波长：450nm
6. 两个相邻色谱峰的分离度应大于1.5。
（二）混合对照品溶液的制备
精密量取PriboFast ® STD#1082AFT黄曲霉毒素混合对照品溶液（黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2标示浓度分别为1.0μg/mL、0.3μg/mL、1.0μg/ mL、0.3μg/ mL）0.5 mL,置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为储备溶液。精密量取储备溶液1 mL，置25 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。
% s1 e. g( x. \! c（三）供试品溶液的制备
1. 取供试品粉末约15g(过二号筛)，精密称定，加入氯化钠3g，置于均质瓶中，精密加入70%甲醇溶液75mL，高速搅拌2min（搅拌速度大于11,000 r/min,普瑞邦均质器Pribolab® WR800: 转速22,000 r/min）。
2. 4000r/min离心5分钟。
( @) u+ y) i8 s$ n% @7 l, x3. 精密量取上清液15mL，置50mL量瓶中，用水（专用淋洗缓冲液）稀释至刻度，摇匀，离心10分钟（离心速度4000r/min）
4. 准确移取20.0mL样品提取液，过PriboFast® 免疫亲和柱，过柱时流速不能快，流速快的话回收效率差，建议采取重力过柱。
( w1 `0 _- t( ]  p3 @% o5. 用水20mL洗脱（必要时可先用淋洗缓冲液10mL淋洗，再用10mL水淋洗），洗涤液弃去。
' t' `2 Q2 L3 h2 i6. 为保证洗脱充分，建议以2.0mL色谱甲醇分三步进行洗脱，重力洗脱即可。首先，加入1.0mL甲醇洗脱，当溶剂通过柱子后，孵育30s（孵育即甲醇在柱子中浸泡）；然后，再加入0.5mL甲醇进行洗脱，过柱前孵育30s；最后，再加入0.5mL甲醇洗脱，过柱前孵育30s，并使2-3mL空气通过柱体，收集洗脱液，置2mL量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。(免疫亲和柱操作建议使用PriboFast®泵流操作架,便于控制各个步骤流速,保证较好的回收率)
7. 测定法：分别精密吸取上述混合对照品溶液5μL、10μL、15μL、20μL、25μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线。另精密吸取上述供试品溶液20～25μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，从标准曲线上读出供试品中相当于黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的量，计算，即得。
第二法 液相色谱-串联质谱法
4 R: K+ X( x, ?1 E: |# s本法系用高效液相色谱-串联质谱法测定药材、饮片及制剂中的黄曲霉毒素（以黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2总量计），除另有规定外，按下列方法测定。
/ T" ?" `# P  F9 N+ y; k（一）色谱、质谱条件与系统适用性试验
; ^- w* X, U( w6 o4 l( t, f" a以十八烷基硅烷键硅胶填充剂；以10mmol/L醋酸铵溶液为流动相A，以甲醇为流动相B；柱温25℃；流速0.3mL/min；按下表中的规定进行梯度洗脱。

以三重四极杆串联质谱检测；喷雾离子源ESI)，采集模式为离子模式；各化合物监测离子对和撞压(CE)见下表。

（二）系列混合对照品溶液的制备
精密量取黄曲霉毒素混对照品溶液（黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2标示浓度分别为1.0μg/mL、0.3μg/mL、1.0μg/mL、0.3μg/mL）适量，用70%甲醇稀释成含黄曲霉毒素B2、G2浓度为0.04〜3ng/mL，黄曲霉毒素B1、G1浓度为0.12〜l0ng/mL的系列对照品溶液，即得（必要时根据样品实际情况，制系列基质对照品溶液）
- O  x) o  e8 l0 d6 x; j（三）供试品溶液的制备同第一法
测定法精密吸取上述系列对照品溶液各5μL,注入高效液相色谱-质谱，测定峰面积，以峰面积纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准。另精密吸取上述供试品溶液5μL，注入高效液相色谱-串联质谱，从标准曲线上读出供试品中相当于黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的量，计算，即得。
第三法 酶联免疫法
本法系用高效液相色谱-串联质谱法测定药材、饮片及制剂中的黄曲霉毒素（以黄曲霉毒素B1，或黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2总量计），除另有规定外，按下列方法测定。
（一）标准品溶液的制备
精密量取 PriboFast®STD#1041黄曲霉毒素B1标准品溶液，PriboFast®STD#1082AFT黄曲霉毒素混合标准品溶液用硫酸盐缓冲液稀释成每1L含0 μg、0.05 μg、0.15 μg、0.45 μg、1.35μg（测定黄曲霉毒素B1）或0 μg、0.025 μg、0.075 μg、0.225μg、0.675 μg（测定黄曲霉毒素总量）的系列标准品溶液，即得。
  F# Z* P! e; u& W3 N（二）供试品溶液的制备
1. 供试品粉末2.0g至50mL离心管中，20mL甲醇振荡5min，离心5min（3000r/min）。
- z% v7 V  [$ D5 W) P& j0 v2. 取2mL上清液至10mL干净离心管中，50-60℃水浴氮气流下吹干。
6 `; z5 A$ O" K' S3. 加入2mL去离子水振动30秒，加入6mL三氯甲烷振荡2min，离心5min（3000r/min）。
4. 取下层三氯甲烷液3-10mL于离心管中，置氮吹仪于50-60℃水浴浓缩至干，加入1mL正己烷涡旋30秒，再加入2mL磷酸盐缓冲液涡旋1min，离心5min（3000r/min），取下层液，即得。
5 A& x9 r; m5 u- z6 ~; n# p  }（三）测定法
% g, q, W2 d. I  w$ A4 x黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素总量的测定：分别采用合适浓度的抗体包被微孔板孔，经封闭、干燥等处理后加入系列标准品溶液，再加入经酶标抗原稀释液稀释至合适工作浓度的酶标抗原，混匀，于25℃反应45min，用洗涤工作液洗涤，每孔加入底物显色液100μL，于25℃反应15min，每孔加入终止液50μL，采用酶标仪于450nm处，参比波长630nm，测定每孔吸光度值。
2 @' ^; Y) ^. Q/ w( Z+ t* c3 m) o/ P注：
（1）测定前，可选择阴性样本进行添加回收试验，样本回收率应在60%-120%。
- y) z( X1 [* G0 z1 j8 K# F) I+ `（2）线性回归的相关系数应不低于0.990。
4 M7 z6 k, z, M0 _/ p（3）供试品溶液百分吸光率超出标准曲线范围时，须对已制备好的供试品溶液进行稀释，使其百分吸光率落入曲线范围后再检测。
+ r0 |- J) _7 M' Z- i0 w2 a（4）当测定结果超出限度时，采用第二法进行确认。

[size=1.2em]【附注】
2 o  h1 d' V  e7 E  M1. 本实验应有相应的安全、防护措施，并不得污染环境。
2. 残留有黄曲霉毒素的废液或废渣的玻璃器皿，应置于专用贮存容器（装有10%次氯酸钠溶液）内，浸泡24小时以上，再用清水将玻璃器皿冲洗干净。

[size=1.2em]二、2020版药典相比2015版药典检测黄曲霉方法变化解读

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[size=1.2em]三、SN/T 4604-2016 进出口中药材中真菌毒素的测定（节选）

[size=1.2em]1. 范围
本标准规定了进出口中药材中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2，赭曲霉素A，伏马毒素B1、B2，T-2毒素，HT-2毒素，二羟基苯甲酸内脂类真菌毒素的液相色谱-质谱/质谱检测方法。
本标准适用于进出口当归、桔梗五味子、枸杞、大青叶、金银花、地龙中黄曲霉素B1、B2、G1、G2、M1、M2，赭曲霉素A，伏马毒素B1、B2，T-2毒素，HT-2毒素，二羟基苯甲酸内脂类真菌毒素的液相色谱-质谱/质谱检测方法。
2. 分析步骤
(1) 提取
" H& j6 n  ~8 O# m; l称取5g试样(精确到0.01g)置于50 mL具塞塑料离心管中，加人1g氧化钠，再加人PBS溶液25 mL，均质提取2 min，5000 r/min离心10 min，将全部上清液用玻璃纤维滤纸过滤后得提取液A；向残渣中加人25 mL甲醇，均质提取2 min，5000 r/min离心10 min，取上清液10 mL，用PBS稀释至100 mL，用玻璃纤维滤纸过滤后得到提取液B。
: H1 s8 C0 E4 }0 ?3 c9 Q5 n(2) 免疫亲和柱净化
称取5g试样(精确到0.01g)置于50 mL具塞塑料离心管中，加人1g氧化钠，再加人PBS溶液25 mL，均质提取2 min，5 000 r/min离心10 min，将全部上清液用玻璃纤维滤纸过滤后得提取液A；向残渣中加人25 mL甲醇，均质提取2 min，5000 r/min离心10 min，取上清液10 mL，用PBS稀释至100 mL，用玻璃纤维滤纸过滤后得到提取液B。
将免疫亲和柱连接于10 mL玻璃针筒下,将50 mL提取液B全部通过免疫亲和柱(PriboFast®复合免疫亲和柱)(流速控制在1滴/s~2滴/s)然后用10 mL含0.1%吐温的PBS淋洗亲和柱，再将5mL提取液A通过免疫亲和柱（流速控制在1~2滴/S）。待提取液全部通过亲和柱，用5mL含0.1%吐温的PBS和20mL水淋洗亲和柱，直至空气进入亲和柱，弃去全部流出液；用2 mL甲醇淋洗亲和柱(流速控制在1滴/S)，当甲醇大部分过柱时，停止加压，静置孵育5 min，再用2 mL甲醇淋洗亲和柱(流速控制在1滴/S)，收集全部淋洗液；将淋洗液置于40℃下水浴氮气吹干，用1 mL甲醇-2 mmol/L乙酸铵溶液(含0.1%甲酸)(40：60体积比)溶解残渣，过0.22 μm有机系滤膜，用液相色谱-质谱/质谱测定。

[size=1.2em]四、复杂中药材样品测定解决方案

[size=1.2em]针对目前药典方法检测中药材中黄曲霉毒素过程中出现的决明子、远志、槟郎等个别样品基质复杂，净化效果差，谱图中杂质峰过多的问题，普瑞邦技术中心制定了一套针对中药材前处理的解决方案。应用此解决方案进行样品前处理，经高效液相色谱柱后光化学衍生进行检测可达到较好的净化效果，杂峰明显减少，使分析结果更加准确。供广大同行老师参考：

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: g2 ^0 X6 ^9 B$ ?) p/ G, F

[size=1.2em]图1 方法优化后（左）与优化前（右）远志样品过柱对比

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[size=1.2em]图2 方法优化后远志样品加标与标准品叠加对比

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[size=1.2em]图3 方法优化前远志样品加标与标准品叠加对比

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[size=1.2em]五、Auto IPS-6060 全自动免疫亲和操作仪应用于药典中黄曲霉毒素测定

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[size=1.2em]通过Auto IPS-6060 全自动免疫亲和操作仪在2015版药典中检测黄曲霉的案例，对比手工的精密度和回收率。全自动免疫亲和操作仪不但在具体的方法操作和技术运用上更加先进，而且在整个分析过程中都有非常严格的质量控制和质量保证，确保分析结果准确，排除人为操作造成的实验误差。

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黄曲霉毒素B、G混标
表1：精密度与回收率比对表

4 I" [$ O% ?7 i9 |  P. |; g1 }

序号	手动	IPS	( p+ y* n: E# ?0 R			# ]" z1 x( w9 u) l; O+ A) ^
结果μg/kg	回收率%	精密度%	结果μg/kg	回收率%	精密度%
1（远志样品）	ND	——	——	ND	——	——
2（远志加标）	7.03	70.3	11.1	7.74	77.4	5.7
3（远志加标）	8.71	87.1	8.66	86.6		j1 f" z# O. T0 r5 ?6 `4 \
4（远志加标）	7.53	75.3	8.05	80.5		! U6 a4 F3 [' g$ [+ t# H& j

[size=1.2em]*注：上表采用远志样品，按照10μg/kg进行添加。
表2：成本及操作比对表

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对比	时间成本	操作
手动	2h	复杂
IPS	1h	简单
IPS优势	节省1h	简单、一致性好

2 N) l) ?# `  S4 k

[size=1.2em]*注：上表按照4支柱子进行对比。
* b! I) v1 E! Z+ x% j) l/ OAuto IPS-6060 全自动免疫亲和操作仪在进行过免疫亲和柱实验中得到了优于手动过柱的结果，通过比对不难发现，Auto IPS-6060 全自动免疫亲和操作仪在回收率和精密度方面有所提高，大大节省了人力以及时间成本，同时也缩短了实验人员接触试剂的时间，最大程度地保证了实验人员的安全。

- Z/ B8 c. B' _+ r- g( X3 e& [

[size=1.2em]六、中药材黄曲霉毒素测定采购指南

产品描述	规格	货号	备注
KRC光化学衍生器	KRC-15	KRC10230	Pribolab
254nm低压紫外灯光源+15米反应池	8W	——	标配
MDU 光化学衍生器	MDU-I	MDU20230	Pribolab
低压紫外灯光源+全透明质化反应池	9W	——	标配
液相色谱柱 MycoChrm C18	5μm4.6*150	185150	AFT专用
不锈钢高速均质器	1.1L	EQ-800S	>20000r/min
中药材专用黄曲霉毒素 # P; ?: o0 z' @  j& d8 }免疫亲和柱（1mL）	25T	IAC-011-1	——
中药材专用黄曲霉毒素 " o2 @4 S0 v! ~1 p2 @9 n$ Y" n# E( x免疫亲和柱（3mL）	25T	IAC-011-3	——
多毒素复合免疫亲和柱	15T	IAC-400-6	出入境标准
中药专用缓冲液	份	——	标配
固定/旋转泵流操作架	8/12位	EQ-RACK 8/12	——
玻璃纤维滤纸	100P	GF/A-110	110mm 1.5μm
PEEK两通	2P	SP0802	——
黄曲霉毒素总量混合标准品 + [3 T  C1 u/ f4 D" s( D7 [8 m# \(AFB1,G11.0μg/mL;AFB2,G20.3μg/mL)	1mL	STD#1082	——
收集瓶	——	20个	——

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[size=1.2em]*备注包括1年免费保修和终身维护(反应池和纳米灯管除外).

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[size=1.2em]七、中药材黄曲霉毒素测定常见问题举例

[size=1.2em]1. 样品中目标峰保留时间发生偏移
1 B7 `8 v' G; t, t4 F4 M2. 部分中药材前处理不干净，液相杂峰多
3. 样品中峰的定性判断
& B- \, F6 w( w6 p6 \: I4. 远志、槟郎等过柱困难的样品处理
3 K7 F5 \% E5 L! F7 i: V; w' J' U5. 液相色谱峰拖尾或前沿
6. 色谱柱如何维护
7. 标准品的保存与分解
8. 样品加标回收的方法
9. 曲线线性不好
+ b; y4 p5 R  `1 I: S2 o+ J10. 基线不平，噪音大
+ Z  {  {0 f- |
注：本文为转载文章，仅供学习探讨，以2020版药典为准。
本文件中的信息，如有改变，恕不另行通知。

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