不同缓冲液流动相配制方法对分析结果有什么影响？

不同缓冲液流动相配制方法对分析结果有什么影响？

8 \, t. g/ |/ s答：HPLC的流动相主要用水性溶剂（水以及缓冲液）、有机溶剂、或它们的混合液。但不同资料上对缓冲液的表示方法不一，因此往往会对缓冲液有不同的解释，使得资料上表示的内容与实际配置的方法不同，而产生流动相的差异，影响色谱图和分析结果。而且，不仅是缓冲液，有时还要考虑到溶剂的混合方法等流动相配制方法等因素。下面以具体的事例，说明流动相配制方法对分析结果的影响。
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（1）缓冲液的配制
) L% O' l- v7 V' d+ B“20mM磷酸缓冲液(pH2.5)”如何配制，由于表述的不清楚，有许多种可能的配法，就是以钠离子而言，“20mM”也不清楚是磷酸还是磷酸钠的浓度。若认为是“20mM”磷酸（钠）缓冲液，“20mM”可看作是磷酸的浓度。另一方面，若把“20mM”看作是钠的浓度,也可以认为是“20mM磷酸二氢钠水溶液调节pH后的缓冲液（而且，20mM磷酸钠水溶液的pH在5.0附近，只要稍用一点酸就可调到pH 2.5）。这时，由于调节pH用的酸，产生离子对的效果，会对分析结果有影响。
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+ a& w# _. }! P% u6 G这三种不同的解释，在实际中对分析结果有很大的影响，见图3.6所示。A是“20mM”作为磷酸浓度解释，将作为“20mM磷酸（钠）缓冲液（pH2.5）”调节的溶液用于流动相的结果。B和C“20mM”作为磷酸二氢钠的浓度解释，分别加磷酸和高氯酸调节pH为2.5时的结果。可见，不同的缓冲液配制方法对二氢可待因的保留时间有明显的影响，这给分析造成一定的困难。因此，对缓冲液应尽量明确溶液的特性和配制方法（尤其pH的调节），以免产生不同的解释。


（2）有机溶剂和水性溶剂的混合方法
有机溶剂和水性溶剂的混合液是经常作为流动相用的，但由于混合方法的不同，有时分析结果相差很大。如上例中，采用20 mM磷酸(钠)缓冲液（pH 2.5）与乙腈的混合液时，若混合比为9:1，即20 mM磷酸（钠）缓冲液（pH 2.5）与乙腈的体积比为9:1，也就是可以解释为各自按体积比量取后进行混合。另外，也可以理解为20 mM磷酸(钠)缓冲液（pH 2.5）中含有10％的乙腈。按两种理解方式配制的流动相会对分析结果（特别是保留时间）有显著的影响，这点必须注意。
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) r2 }. M+ W) |. d" Y+ o在一般的情况下, 配制HPLC用流动相时，用A液:B液=3:2(V:V)的表示方法，即A液体积比相当于3，B液体积比相当于2，分别量取混合（实际上混合后的溶液体积要小于5）。


（3）流动相缓冲液pH的调节
流动相A：20 mM磷酸(钠)缓冲液（pH2.5）90%与乙腈10%混合，流动相B：20 mM磷酸(钠)缓冲液90%与10％乙腈混合，pH2.5。前者缓冲液的pH为2.5，但混合后pH会发生变化，后者含有机相混合液的pH为2.5，两者有明显的区别，分析结果也会不同。
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* M' g/ R' |! p$ q& e在一般情况下，pH值仅指缓冲液的pH，不含有机相。总之，不仅是流动相的配制方法，试样溶液和其他溶液的配制也经常有上述问题。另外，在不同部门（医药部门或化工部门）各自都有自己的常识和习惯，在这种情况下，参考相关的标准和规范，以避免混乱。

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