【不断更新】western blot实验技术和方法集锦

2016-01-25 然科生物
: z2 }6 J2 w+ m+ K1、WB标准protocol

成功完成Western Blot检测，必须满足4个条件：

1凝胶洗脱：转移期间蛋白质必须从凝胶中洗脱出来，如果蛋白质还截留在凝胶中，将无法在膜上进行分析

2吸附到膜上：在转移过程中蛋白质必须吸附到膜上，如果蛋白不吸附，将无法在膜上进行分析

3处理期间仍截留在膜上：在转移后的处理过程中蛋白质必须保持吸附在印迹膜上

4处理过程中可接近：被吸附的蛋白质必须能够与检测试剂接触，如果蛋白质被掩盖则无法检测

成功进行WB检测，则设置合适正确的对照是必不可少的，只要正确设置了这些对照，即可快速和准确的找到WB的问题所在，并保证实验结果的准确性和特异性！一般需要设置的对照如下：

l 阳性对照：明确表达检测蛋白的组织或细胞，用于检测抗体的工作效率

l 阴性对照：明确不表达检测蛋白组织或细胞，用于检测抗体的特异性

l 二抗对照：不加一抗，用于检测二抗的特异性

l 内参对照：检测标本的质量和二抗系统

l 空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果

WB检测基本过程

1、获取细胞或组织裂解物

1)根据检测蛋白的位置选择合适的裂解buffer：

蛋白位置 9 y7 w* ]3 s$ T% p	推荐buffer : H( B& N; J6 D& o% s# ~
全细胞	NP-40 or RIPA
胞浆（可溶性蛋白）	Tris-HCl & |3 z3 u$ B: i9 n" Q
胞浆（骨架结合蛋白） 0 ~0 j8 X8 u1 f	Tris-Triton
膜蛋白 % f- `& h! F2 T; l6 g, U- o/ O	NP-40 or RIPA
核蛋白	RIPA or 核蛋白提取试剂盒 + O1 j: A* S% E) D) ]6 f
线粒体蛋白	RIPA or 线粒体分离试剂盒 % l+ s3 |& P: d3 _- f- W6 c- ~1 w  k+ U

亦可购买商业化的蛋白提取试剂盒来保证标本制备的质量

2)选择合适的蛋白酶抑制剂，避免蛋白降解，从而保证检测的准确性！

2、蛋白定量

常用的蛋白定量方法：Bradford assay,Lowry assay 或BCA assay。定量后，可根据情况将标本保存在-20°C /-80°C备用，进行免疫沉淀（IP）或者直接进行电泳分离蛋白

3、电泳分离蛋白质

根据待测蛋白状态确定电泳条件：

待测蛋白状态	凝胶条件	上样buffer / [6 j3 T2 @% a	电泳buffer
Reduced - Denatured	还原，变性 $ K0 p' W0 Z" P* \! b	含β-巯基乙醇或DTT，含SDS	含SDS # W2 d- ~$ Y4 J" F: n$ Z7 p
Reduced - Native ) x  c: o8 ?3 @; {, D. n: r2 U	还原，不变性	含β-巯基乙醇或DTT，不含SDS	不含SDS   q8 D5 M( {# z" Z! w
Oxidized - Denatured & n& z5 q! A7 _+ ?! y# [+ F	不还原，变性   Q- P, g$ s) H, {& v, N	不含β-巯基乙醇或DTT，含SDS	含SDS / p3 y  z- F" j4 T/ T
Oxidized - Native 2 F: m, F0 N- S* V  G8 X	不还原，不变性	不含β-巯基乙醇或DTT，不含SDS 5 j0 V  j& n1 N& Y	不含SDS

根据待测蛋白分子量大小确定凝胶浓度

蛋白分子量（kDa）	凝胶浓度（％）
4-40 , K& b! a$ H3 e6 g0 j; ~! D	20 4 N# V/ K7 G* e: _  o9 f- i7 n
12-45 ( G$ N, a* D, |& b0 {	15
10-70	12.5
15-100 1 A0 h# O, ~. O# n! |" k& \	10
25-200	8 : X6 a: y- D! r+ a' P

4、转膜

根据不同的检测目的和待测蛋白的特性，选择合适的膜类型。常用的转移膜类型有：PVDF膜、硝酸纤维素膜（NC膜）和尼龙膜，其中PVDF和NC膜的使用频率最高。各种膜的技术参数及比较如下：

a0 m! f7 D- k- U) S1 i$ R	PVDF膜	NC膜 # H& S% T7 Z" x2 ?1 M	尼龙膜
灵敏度和分辨率 ) _5 u2 ~0 s. [- H1 h* [9 Y: C	高	高	高 0 C& F4 U9 F! k* I% F
背景 % a, w* w# K2 [* t. p& @  a- e6 t	低	低	较高 , r3 b( B8 h! |" |6 V# Z( }" j
蛋白结合能力 # `" y. Z1 x  w' A' g% i! e# [	100-200ug/cm2（适用于SDS存在时与蛋白结合） & ?3 `1 m3 k* `	80-100ug/cm2	>400ug/cm2
机械强度 ( u  K7 u- B; ~2 J7 d	强	干的膜易脆 ( @/ [( y& I# f0 d( o	软而结实 ' N; v% |6 r. ^. Q0 o6 y
溶剂抗性	强	差 9 F0 e0 n% r- s	差
使用前是否需要浸润 4 s+ t  ]' X. ~5 n8 ?+ c  H" ^+ B, D  J	100%甲醛润湿	缓冲液润湿 : ]: K, z( }* ?7 G, @	缓冲液润湿
适用染色方法	胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁、考马斯亮兰 8 m7 |3 z3 @$ ]	胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁	不能用阴离子染料 5 n; g" ~5 i4 u2 [9 R
适用检测方法	显色法、化学发光、荧光、放射性、化学荧光、快速免疫检测	显色法、化学发光、荧光、放射性 6 a0 V: \5 P$ n$ V6 a2 Y; A	显色、化学发光、放射性
适用范围	普通蛋白WB、糖蛋白检测、蛋白质测序、氨基酸分析、重复检测	普通蛋白WB、氨基酸分析、重复检测。0.1um膜适用于7kDa以下蛋白	低浓度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白、蛋白多糖、核酸检测常用 3 l' K7 e  G, l* \
价格	高 . k8 A' u1 @" ]; f	较低	低

5、封闭

去掉膜上多余的非特异性结合位点，降低背景。常用的封闭溶液有：含BSA或者脱脂奶粉的TBST或TBS

6、一抗孵育

一抗的选择成功与否，是整个WB实验成功的关键：选择一抗有以下几个注意点：

l 选择适合检测标本种属的一抗（说明书有验证）

l 选择适用于WB实验方法的一抗（说明书有验证）

l 选择单克隆抗体或者经过亲和纯化的多克隆抗体

一抗的保存和使用：

l 根据说明书的要求条件进行抗体的保存；一般需要将抗体分装后放入-20度保存，绝对避免反复冻融。

l 抗体的工作液最好现配现用，在4度保存最好不要超过2周

l 根据说明书推荐浓度使用TBST稀释一抗。由于实验室条件和检测方法等的差异，说明书推荐的稀释比例只作参考，需要在说明书推荐的浓度周边进行多个浓度梯度的实验检测，然后选择信噪比最好的抗体浓度进行实验。如果说明书没有推荐浓度，可进行多个稀释比例进行摸索最佳稀释度（1:100-1:3000）。

l 孵育条件：推荐4°C孵育过夜（一般大于18个小时），根据抗体亲和力不同孵育时间有所区别

7、二抗孵育

根据说明书推荐浓度使用TBST稀释一抗。如果说明书没有推荐浓度，可进行多个稀释比例进行摸索最佳稀释度（1:1000-1:20000）。孵育条件一般为室温1-2小时

8、底物孵育

选择显色或者化学发光底物。一般倾向于化学发光，灵敏度高且背景低，节省抗体用量

9、结果分析和检测

凝胶成像系统检测或者暗室曝光到胶片

Note：从封闭开始，每步之间都需要用TBST进行洗涤，3次，每次5min

WB技术要点和常见问题分析

WB过程中常见的问题及可能原因分析

问题 ; J$ \% G7 T) T1 K! Q5 k, m	可能原因 * u0 t$ I  Q; F  M& G	验证或解决办法
转膜不充分	膜没有完全均匀湿透	使用100% methanol浸透膜
	靶蛋白分子量小于10,000	选择小孔径的膜，缩短转移时间 & B3 @# u% w! u. `4 M  X" K2 _! P
	靶蛋白等电点等于或接近转移缓冲液pH值 ( y- e1 K4 X! w, U( p. R  C, n	可尝试使用其他缓冲液如CAPS缓冲液（pH 10.5)或使用低pH值缓冲液如乙酸缓冲液 & i: ^1 X& A4 g. K2 r
	甲醇浓度过高	过高甲醇浓度会导致蛋白质与SDS分离，从而沉淀在凝胶中，同时会使凝胶收缩或变硬，从而抑制高分子量蛋白的转移。降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替
	转移时间不够Thick gel 6 ~+ |. R$ X5 A9 `! C% f	对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转移时间 * c) t7 Z4 j: B" ?5 F0 |
背景高 3 j7 ~' U2 W' a- L9 x. w* M3 t% b  j	膜没有完全均匀湿透	使用100% methanol浸透膜 5 ^( c- I# h  ^
	洗膜不充分 , H% ^3 J5 p( Y) G1 h, T1 _	增加洗液体积和洗涤次数 + N% ?; V0 P1 d& Z* u$ I
	阻断不充分 7 R. g8 L  M$ Y- J" J	增加封闭液孵育时间，或者提高温度。选择合适的封闭试剂（脱脂奶粉，BSA，酪蛋白等）
	二抗浓度过高 9 s: W2 C4 M; c1 W5 _9 v# H0 i	降低二抗浓度
	检测过程中膜干燥 5 X) k, M& \1 D0 [- C	保证充分的反应液，避免出现干膜现象 & W6 R5 s. d+ _; @( K: Q, ]
	曝光过度	缩短曝光时间
	抗体与阻断蛋白有交叉反应 , j% G2 w2 K9 h1 n. W# |* u	检测抗体与阻断蛋白的交叉反应性，选择无交叉反应的封闭剂。洗涤液中加入Tween-20可减少交叉反应 + X9 P) S; v  S2 N) e% l
没有阳性条带	抗体染色不充分	增加抗体浓度，延长孵育时间
	酶失活 ) P9 o$ l3 O; @& E	直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物 9 p/ m- j: x0 U+ b: \% p1 ?
	标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低 . f( O6 w/ v! j: ?0 k& b	设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考虑增加标本上样量解决靶蛋白含量低的原因。
	试剂不匹配 9 ^( t, \5 t& p6 t2 j) m	一抗与组织种属，一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹配。通过设置内参照可以验证二级检测系统的有效性 ! p: \/ J4 X. d
	一抗失效	选择在有效期内抗体；并选择现配现用的工作液
	HRP抑制剂	所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠 2 E; V4 n) n* C4 b0 z4 {" i' \
有阳性条带，但条带比较弱 6 I2 h0 }  s8 m# D6 e# |	抗体染色不充分 * u! n, D! _) w1 |, o/ ?' x9 s	增加抗体浓度，延长孵育时间
	酶活性降低 % O; d& b3 z4 j% u/ p* O- R' P0 h; s	直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物
	标本中靶蛋白含量太低	增加标本上样量。
	洗膜过度 5 r4 a, m' h& F. B4 a6 T	缩短洗涤时间 7 I4 X0 k3 C1 l* ]
	HRP抑制剂 , ^7 b& i" ~8 X- Z' j. R; L' r	所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠
	抗体活性降低	选择在有效期内的抗体，工作液现配现用，避免长时间放置 & R  C- }  M/ f( m3 L! S: R) o
	蛋白转移不充分	见上述
	封闭过度 & D: X8 h2 c  q$ Y$ r  Z	减少封闭剂的量或缩短时间；换用不同封闭剂类型
	曝光时间过短	延长曝光时间 ! E6 X7 j5 v/ [. {; y* j0 T
	HRP抑制剂 % T% \+ `8 @  i- P% n/ z+ Z3 ^1 u	所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠 " ?) w0 w* b$ W' Z. }- Z
条带位置（大小）不对；或有非特异性条带	二抗的非特异性结合 3 _: \) `: x3 \# q6 }4 E+ B	增加一个对照：不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否由二抗系统来源。选择其他二抗（特异性更强的，只针对重链的）
	一抗的特异性不够	使用单克隆或者亲和纯化的抗体，保证抗体的特异性 , N& U* Y  S/ X4 z0 V* n
	蛋白降解 + k8 |2 @$ t% A4 M	使用新鲜制备的标本，并使用蛋白酶抑制剂
	二聚体或多聚体存在 $ i  L1 B- }' r0 a: Z* S* I+ h, ~	增加蛋白质变性过程及强度
	抗体浓度过高 ' K. |0 n' Q7 F; ]	降低抗体（一抗、二抗）浓度，可以减少非特异性条带
	蛋白上样量过大	降低上样量
背景有斑点	封闭剂中有聚集体	使用前过滤封闭试剂
	HRP耦联二抗中有聚集体 ) k0 u* C0 F7 @7 z8 u+ }; f+ [; ?	过滤二抗试剂，去除聚集体
膜上出现反像（暗背景上白色带） " z7 |0 \2 f, v( m- X. f  S! D	HRP含量过高	降低酶联二抗的浓度 , y/ @8 B  S/ p" v

$ ?' ?0 Z  K5 z  w  z' y& T2、【经验】荧光western blot应注意些什么？？？随着荧光检测的普及，许多研究人员正考虑将western blot的检测方法从化学发光转到多重荧光。这一趋势背后有多个推动力。最重要的是，荧光检测能够实现多重western blot分析，每次能够同时检测几个目标蛋白，而不再需要剥离和重新杂交。荧光的其他好处在于动态范围更宽、信号稳定性更好。
7 z0 G7 E* V, N3 Z
0 ^. J) b* s% z; r& T荧光blotting的小贴士
& P: Z% a2 g) p. T& W

• 抗体浓度应当优化,在几种不同稀释度的抗体中孵育膜。选择信噪比最高的稀释度。

, J8 ]" N3 K! u4 R1 u; s• 从化学发光转到荧光检测时,一抗浓度应当增加;通常来说是增加2-5倍。二抗浓度可能也需要优化；1:5,000稀释是个不错的起点。在使用特定抗体时，可以参照生产商的建议。

" D# Z* w7 b# I0 G• 为了让信噪比最高,应使用自发荧光低的膜;

% F7 J5 v$ `+ t0 q9 K- D% V• 许多封闭液都成功用于荧光检测。我们建议使用0.5-5%酪蛋白、最多5%的脱脂奶粉或最多3%BSA,溶于TTBS中。

$ x- U' t9 P6 q# ]5 O• 缓冲液中的颗粒可能停留在膜上，并造成荧光假象。只使用高质量的试剂，并对所有缓冲液过滤灭菌。

( U2 E) e( u2 k: U• 使用钝的镊子从边缘操作。避免划破膜或弄皱,这会在荧光检测时造成假象。

• 使用铅笔来标记膜,因为许多墨水都会发出荧光。

• 溴酚蓝会发出荧光。确保染料与样品已分开,切掉凝胶上包含染料的部分或省掉样品缓冲液中的溴酚蓝。

• 无需在暗处开展免疫检测；正常的室内灯光不会使荧光标记的抗体发生光漂白。不过,荧光标记抗体的储液应保存在暗处。

• 在处理膜时,使用无粉末的手套,以避免膜上出现假象或指纹。

多重分析的小贴士
4 C/ |/ e" V1 Y* a' O
( H" q% s, j) @: o$ _. u

• 使用来自不同宿主的一抗(如小鼠和兔)。两个亲缘关系相近物种的抗体(如大鼠和小鼠)通常会造成交叉反应,即使抗体已经过交叉吸附。

• 使用经过交叉吸附的二抗,以避免交叉反应。

% g6 d, Q) z3 R# r5 w• 使用光谱上不同的荧光基团偶联物,避免交叉通道荧光。

# u: U1 c+ M0 u0 _* [* T3 {4 q• 在同时检测多个目标之前,单独优化每个目标的检测。由于一些一抗并非很特异,在膜上会产生多条带,故多重实验之前的单目标检测将有助于确定每个抗体的条带模式。

• 大部分膜在波长较短的激发光下会显示出较高的背景。记住，在蓝色通道检测最强的目标,在绿色通道检测中等目标，而保留红色通道来检测最弱的目标。

0 X: b7 D5 y2 J* P; B+ R- h4 K3、【10】个WB实验常见问题解答
; R" t0 e( C" k6 @  O
; j- h% ?% d9 {# h  [/ H$ t问答
1在western实验中，通常有人采用TBS，有人采用PBS，在使用中有什么区别？选择合适的缓冲液对于维持一定PH值下蛋白质的稳定及保证实验的重复性是很重要的。PBS的缓冲能力强于TBS（因为混合缓冲液在一定的离子强度下常常具有更宽的缓冲范围）,TBS在PH7.0以下缓冲能力较弱（不过PBS易污染）。但我们常常要根据我们实验目的选用合适的缓冲液,如在蛋白纯化中进行阴离子交换层析，阳离子缓冲液首选TBS;阳离子交换层析时，阴离子缓冲液则首选PBS。

! o5 A! e7 Z4 ?, E- m6 m  q4 ?western blot中使用TBS和PBS均可,只是要根据需要选择合适的浓度。

2没有注明可以用来做western blot的一抗，可以用来做western blot吗？不一定,因为有的抗体是识别线性表位的,有的是识别构象型表位的，识别构象型表位的抗体不能用于western blotting，因为在western blotting中抗体识别的是完全变性的蛋白质抗原，而蛋白质抗原的构象型表位变性时被破坏。3做western每次只加一种一抗，可以同时加两种或者多种一抗的吗？最好还是不要同时加两种一抗。因为如果结果里面有非特异信号的话，就说不清楚了。做Western在同一张膜上检测目的蛋白和内对照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗，ECL显色、压片、洗片；漂洗以后，再上内对照的一抗、二抗，ECL显色、压片、洗片。4Western blot 使用的膜哪种最好啊，PVDF好还是NC膜，如何选择？VDF膜价格较贵，可重复使用，特别适合蛋白印迹，结合能力较强，但价格比较昂贵。 NC膜价格比较便宜，应用较广，结合牢固性差一些，韧性也不如PVDF，不能重复使用，但蛋白吸附容量高，亲水性较好。 都可以用丽春红染色。具体使用还要参考相关文献5为什么出现了多条带,每个加样槽中都出现了多条带，而且好象都很有规律,为什么?是封闭时间不够吗？做WESTERN必须要内参吗？一抗、或二抗抗体浓度太高，多克隆抗体本身的非特异性反应，抗体的特异性不强，目的蛋白经过处理后发生变化,而内参的条带基本均匀一致.这样才有说服力,表明的确是处理因素造成目的蛋白的变化而不是加样误差或认为的造成目的条带浓度的变化.所以严格意义上说,内参是必须做的。6western用的一抗,单抗好些还是用多抗好些？用于western的抗体和用于ELISA的抗体有什么不同的要求？作为western来讲，理论上单抗比多抗的特异性要好，但单抗种类较少一般价格偏高,所以一般来说多抗足够了。用于western的抗体和用于ELISA的抗体，一般来说用于western的抗体识别的是氨基酸序列特异性；而可用于ELISA的抗体则要看抗原种类,有些是识别氨基酸序列特异性,有些是识别构像特异性。所以一般根据抗体说明书来确定。
; d' H0 g" x( K2 P7 D

做免疫印迹时选择抗体主要应考虑两个问题，一是所选抗体是否能识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一个是所选抗体是否会引起交叉反应条带

7不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上， 转移效率低怎么样解决？可以考虑：转移缓冲液中加入20%甲醇（是指终浓度）(优化的转移缓冲液,因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力,甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间;转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS,也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使用小孔径的NC膜（0.2微米）;使用戊二醛交联；低浓度胶,如低至6％。太大时还可以考虑用琼脂糖胶；提高转移电压／电流；增加转移时间8Western Blot哪种染色好？(1)：阴离子染料是较常用的,特别是氨基黑,脱色快,背景低检测极限可达到1.5μg,考马斯亮蓝虽然与氨基黑有相同的灵敏度,但脱色慢,背景高。丽春红S和快绿在检测后容易从蛋白质中除去,以便进行随后的氨基酸分析。缺点是:溶剂系统的甲醇会引起硝化纤维素膜的皱缩或破坏。不能用语正电贺的膜。灵敏度低。(2)：胶体金，灵敏度高,检测范围可到pg级,但染色比稳定。(3)：生物素化灵敏度位于1、2之间,可用于任何一种膜。9western用的一抗,单抗好些还是用多抗好些？用于western的抗体和用于ELISA的抗体有什么不同的要求？作为western来讲,理论上单抗比多抗的特异性要好，但单抗种类较少一般价格偏高,所以一般来说多抗足够了。用于western的抗体和用于ELISA的抗体,一般来说用于western的抗体识别的是氨基酸序列特异性；而可用于ELISA的抗体则要看抗原种类，有些是识别氨基酸序列特异性，有些是识别构像特异性。所以一般根据抗体说明书来确定。
做免疫印迹时选择抗体主要应考虑两个问题，一是所选抗体是否能识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一个是所选抗体是否会引起交叉反应条带。10结合ECL之后显影发现胶片上的条带是空心的，而且荧光很快就没了？一种情况是POD浓度高ECL很快被淬灭掉，导致蛋白丰度越高的地方反而没带，边缘地带反而有显色.
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