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[生、血制品] 2016.11EV71疫苗质量控制和评价技术指导原则

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毛毛 发表于 2016-11-17 16:33:01 | 只看该作者回帖奖励

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               EV71疫苗质量控制和评价技术指导原则

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2016年11月16日发布
引言
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手足口病（Hand-foot-mouth disease, HFMD）是婴幼儿人群常见的急性传染病，主要表现为发热和手、足和口等部位的皮疹或疱疹，可并发无菌性脑膜炎、脑炎及急性弛缓性麻痹等中枢神经系统症状，甚至死亡。多种肠道病毒感染可引起HFMD，肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A组16型（CA16）为引起世界范围内HFMD爆发的主要病原体（1）。HFMD中约90%的死亡病例由EV71感染引起（2），EV71引起的HFMD已成为我国的重大公共卫生问题之一。2015年，我国自主研发的EV71灭活疫苗获批上市（3）。研究制定EV71疫苗质量控制和评价技术指导原则，对规范并提高我国EV71疫苗的质控标准和生产一致性，保证上市疫苗安全、有效和质量可控具有重要意义。

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本指导原则中EV71疫苗是指采用传代细胞生产的全病毒灭活疫苗，或采用重组DNA技术将具有免疫保护性的抗原基因克隆到表达载体上，转化相应的宿主中表达的EV71抗原蛋白，经过纯化等工艺制备的EV71疫苗。
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本指导原则中凡涉及生物制品质量控制的通用要求，均应按现行版《中华人民共和国药典》三部有关规定执行（4）；有关生产设施的要求应参照国家食品药品监督管理总局（CFDA）2010版《药品生产质量管理规范》执行（5）。
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本指导原则仅为对EV71疫苗进行质控和评价技术要求的指导性文件，需根据技术的发展和实际需要进行适当的更新。

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一般考虑
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EV71属于小RNA病毒科，肠道病毒属，为无包膜病毒。EV71颗粒为20面体的对称结构，直径约24-30纳米，由60个亚单位组成。病毒基因组为单股正链RNA，7400核苷酸左右，包含有5’-UTR区和3’-PolyA尾。 EV71的衣壳蛋白主要由VP1、VP2、VP3和VP4组成，其中，VP1、VP2和VP3位于病毒衣壳外部，VP4位于病毒衣壳内部。VP1是EV71主要的抗原表位。EV71只有一个血清型，依据VP1区序列可分为A、B 和 C 3个基因型以及11个基因亚型。我国台湾、香港以及其他国家或地区近年来流行的主要基因型包括B4、B5、C2、C4和C5等亚型（6），我国大陆流行的EV71主要为C4亚型。5岁以下儿童和婴幼儿为EV71易感人群（7）。在后脊髓灰质炎时代，EV71已成为对人类健康危害最大的肠道病毒（8）。

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多个国家或地区的企业和研究机构开展了EV71疫苗的研发，疫苗种类包括全病毒灭活疫苗、基因工程重组蛋白疫苗、减毒活疫苗和多肽疫苗等（9）。其中，我国3家企业研发的EV71全病毒灭活疫苗对EV71感染所致HFMD的保护效果分别为97.4%，94.7%和90.0%（10-12）。2015年12月，CFDA批准中国医学科学院医学生物学研究所和北京科兴生物制品有限公司生产的EV71全病毒灭活疫苗上市（3），为我国及世界范围控制EV71感染相关的疾病，特别是严重HFMD的爆发和流行提供了手段。

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近年来HFMD流行病原谱发生改变，柯萨奇病毒A组6型、A组10型病毒感染引起HFMD的流行呈增长趋势，提出了研发防控HMFD多价疫苗的需求（13,14）。基因工程重组蛋白疫苗中的病毒样颗粒（VLP）疫苗具有易工业化规模生产的优势，且在动物试验上显示良好的保护效果，显示了研发EV71 VLP疫苗的可行性（15,16）。
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本指导原则重点关注EV71疫苗生产的质控和评价，强调生产过程的一致性，同时对研发阶段的疫苗也提出相关标准和要求，以保证研发和生产阶段中疫苗质控和评价方法及标准的衔接。
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1. 临床前质控和评价
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应依据世界卫生组织（WHO）相关文件以及CFDA《预防用疫苗临床前研究技术指导原则》等技术文件进行EV71疫苗临床前质控和评价研究（17-19）。新研发疫苗的质量标准整体上应达到或高于上市疫苗的标准，动物保护试验中疫苗免疫诱导的中和抗体水平和保护效果应与上市疫苗具有可比性。

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1.1 灭活疫苗毒株和细胞基质

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疫苗生产用毒株的筛选和确定是灭活疫苗研发成功的关键。应选择主要流行基因型的毒株（目前我国为C4型）作为疫苗候选株进行筛选，重点关注不同毒株的交叉保护能力和遗传稳定性。采用目前世界范围流行的毒株（B4、B5、C2、C4和C5等）及国内不同地区的流行毒株，和/或构建不同基因亚型的假病毒进行保护能力比较，选择中和能力强且中和范围广的2~3个毒株作为EV71候选疫苗株。挑选主要免疫原性区域（VP1）核苷酸序列一致的毒株进行克隆纯化，并规定代次，建立主种子批和工作种子批。进行扩大培养、发酵、收获、纯化及灭活工艺等适应性研究，选择工艺适应性和免疫原性较好的候选疫苗株作为疫苗生产株。检定项目应包括鉴别试验、病毒滴定、免疫原性、无菌检查、外源因子和遗传稳定性等项，各级种子批VP1区核苷酸序列不应发生改变，同时具有相近的病毒滴度和免疫原性。应依据现行版《中国药典》中的要求，建立符合规定的细胞库用于生产。

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1.2 基因工程重组蛋白疫苗菌毒株和细胞库
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应选择EV71保护性抗原的基因序列作为目的基因，构建基因工程重组蛋白疫苗的工程菌毒株（即生产用菌毒株）。目前，已报道应用于研发EV71疫苗的表达系统包括酿酒酵母、汉逊酵母、毕赤酵母以及昆虫细胞杆状病毒等。构建过程中应筛选目的基因完全正确，表达量高且遗传稳定性好的克隆作为疫苗生产用菌毒株，建立三级种子系统。应规定主种子批和工作种子批的代次，进行鉴别试验、无菌检查、遗传稳定性、抗原表达水平和免疫原性等项检定。其中，汉逊酵母等表达体系应测定整合拷贝数；酿酒酵母表达系统需测定质粒保有率；表达产物应鉴别为目的蛋白，建立表达量测定方法和标准。对昆虫细胞，除应符合常规传代细胞系的要求外，还应考虑对昆虫细胞敏感的和可能引入的特殊污染病毒或外源因子（如螺原体），建立检测方法和质控指标。重组蛋白疫苗诱导的中和抗体与主要流行毒株和/或假毒株的中和交叉能力与灭活疫苗应具有可比性。
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1.3 疫苗有效性评价

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有研究提出EV71全病毒灭活疫苗免疫诱导的中和抗体水平可作为人体免疫保护的替代指标（10,11）。应探讨疫苗免疫不同品系动物后诱导的中和抗体应答，确定适宜的动物模型，开展疫苗免疫原性验证研究，获得疫苗诱导的中和抗体应答数据，包括1剂免疫后不同时间的抗体转归，2、3剂加强后的抗体应答和转归，以及疫苗的剂量效应关系。中和抗体测定常采用经典的细胞病变法（CPE）或其他经验证的方法，假病毒方法可在经过验证及相关性分析后采用（20）。中和抗体水平可采用效价（Titer）表示，推荐采用国家标准品单位（U）或WHO单位（IU）作为中和抗体水平单位进行标化。免疫原性和保护效果评价可选择乳鼠、小鼠及猕猴等作为模型动物。攻毒和免疫方式包括免疫母体后的母传抗体攻毒保护法、抗体被动保护攻毒实验动物法等。应在先确定攻毒株的半数致死剂量（LD50）的基础上，研究获得疫苗动物保护的半数有效剂量（ED50）。可选用上市疫苗作为对照，也可比对报道的疫苗乳鼠保护ED50，综合评定疫苗保护效果（21）。在进行评价时应考虑方法的标准化和规范化，如标准毒株、标准物质以及标准化的动物模型等。

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1.4 疫苗质量特性研究和规程制定
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应依据现行版《中国药典》三部中人用疫苗总论、基因重组产品总论以及相关指导原则等要求，结合自身生产工艺特点等，进行EV71疫苗质量特性研究。内容应包括理化结构确证、杂质及纯度分析、生物活性研究等。在进行全面质量特性研究的基础上建立疫苗的质量标准。

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EV71的中和表位主要包括3个区域，位于病毒的5次对称轴附近：VP1的G-H环、H-I环和VP2的E-F环等（22）。对灭活疫苗，需重点关注与已上市疫苗结构和活性的一致性，包括疫苗中实心（F）和空心（E）颗粒的比例、比活、诱导中和抗体能力以及动物保护效果等指标；对于基因重组VLP疫苗，应对VLP蛋白结构进行鉴别和分析，包括SDS-PAGE或N-末端测序等方法进行VLP分子量和构成测定，采用特异的多抗或单克隆抗体鉴别VP1等抗原基因表达的目标蛋白，氨基酸序列分析、肽图等方法鉴别VLP的一级结构；采用原子力和透射电子显微镜，以及动态光散射等方法测定EV71 VLP的聚集性；应用结构生物学或免疫学手段分析VLP保护性结构位点，研究不同条件下抗原结构改变引起免疫原性的降低等。应分析VLP疫苗与灭活疫苗中E颗粒结构以及免疫原性的相似性，探讨保护位点与灭活疫苗抗原的差异，比对相同蛋白含量或相同活性单位时免疫原性包括交叉保护能力的差异。
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灭活疫苗标准应不低于已上市疫苗，如主种子批和工作种子批VP1区核苷酸序列应与原始种子一致，EV71抗原颗粒特异性峰按面积归一化法计算纯度（高效液相色谱法，HPLC）应在95.0%以上，Vero细胞宿主蛋白和残余DNA每剂不超过设定的标准等。EV71疫苗原液的F、E颗粒与疫苗免疫原性有关，Ｆ颗粒具有更好的免疫原性（23），研发灭活疫苗时建议考虑建立相应的检测方法，制定F及E 颗粒比例的质控标准。在工艺相关杂质控制方面，当应用DNA酶去除残留宿主细胞DNA时，除应关注残留DNA酶的质控外，应考虑小片段DNA的生物学效应及对免疫的影响，必要时应研究相应的检测方法和标准（24）。

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应考虑建立VLP疫苗菌株或细胞表达目的蛋白的鉴别、表达量和遗传稳定性质控标准。结构鉴别是VLP疫苗质控的重点，需在系统鉴别VLP抗原的基础上，选择确定科学、可行的结构鉴别方法和标准，如定期N-末端测序方法等。建立并验证检测残留菌株细胞蛋白、核酸成分、添加的有机溶剂、疫苗纯度以及效力等指标的方法，并初步制定相应的标准。应探讨国家EV71疫苗抗原含量和效力测定标准品是否适宜于所研发的制品，必要时应建立相应的参考品或对照品。此外，应参考已上市的重组类疫苗及重组类治疗用生物制品的相关要求进行质量控制。
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疫苗研发时应关注过程控制，在完成工艺优化和验证后，可将EV71疫苗抗原含量或比活作为一致性监测的主要指标，收集不同批次检测数据，拟定疫苗生产中关键质控点的抗原含量或比活的一致性可接受范围。
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1.5 标准物质研究和应用
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疫苗质量评价与标准物质密不可分，只有采用统一的标示方式，不同国家或地区的疫苗管理、研发、生产及使用者在比较疫苗的关键质量指标，如活性或效力时才能具有可比性。因此，在疫苗研发阶段即应重视建立及应用疫苗标准物质，以保证质量的一致性和检测结果的准确性。用于评价与临床免疫保护效果相关的疫苗关键质量属性，如活性或效力测定时所用标准物质，原则上应来自可溯源至临床试验时具有确切保护效果的原料批次。企业应采用已建立国家的EV71疫苗抗原标准品、中和抗体标准品、效力标准品进行疫苗的质控和评价。在完成工艺优化后，可考虑制备一批EV71疫苗抗原作为疫苗工作对照品，用于对其后研制批次疫苗的质量比对。对企业自建的检测方法，应考虑建立相应的工作参考品或对照品。

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2. 疫苗生产质控和评价

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2.1 疫苗生产中质控考虑要点
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目前上市的EV71疫苗为纯化、灭活的EV71全病毒抗原，经氢氧化铝佐剂吸附制备而成的疫苗。批准生产的细胞基质分别为人二倍体细胞及Vero细胞。疫苗生产实施全过程质量控制，要求对EV71疫苗生产过程的每一工艺环节，以及使用的每一种原辅材料进行质控，并对关键步骤及其工艺参数建立控制范围，建立关键中间产物质控指标。依据WHO和我国对疫苗批签发的相关要求，对EV71疫苗活性成分和杂质的关键质量属性定量检测数据，以及疫苗质控和检测所使用的标准品、工作参考品及对照品均进行趋势分析，以最大程度保证生产疫苗的批间一致性。在EV71疫苗成品效力检定方面，设定了体内效力和体外相对效力双质控标准，为将来用体外相对效力替代体内效力提供基础。

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2.2 疫苗标准物质
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目前已建立的国家疫苗标准物质包括：EV71血清中和抗体国家标准品、EV71疫苗抗原国家标准品和EV71疫苗效力测定国家参考品。第一代EV71血清中和抗体国家标准品（2010国生标字0024），为健康人血清经冻干分装制备而成，包括强阳性（1000U）、弱阳性和阴性质控品组成，用于疫苗诱导中和抗体测定的质控。EV71疫苗抗原国家标准品（2010国生标字0023），为应用Vero细胞基质制备的EV71全病毒抗原（1600 U/ml），用于疫苗抗原活性测定的质控（25）。EV71疫苗效力测定国家参考品（2016国生参字0074），为应用Vero细胞基质制备的EV71全病毒灭活疫苗，经III期疫苗临床试验获得临床保护效果的数据，同时具有较好的稳定性，用于疫苗成品效力检定的质控（26）。

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2015年，WHO生物制品标准化专家委员会批准第一代EV71血清中和抗体国际标准品（1st IS for anti-EV71 serum (Human)，批号：14/140），该标准品为健康人血清经冻干分装制备而成，每支含1000 IU，用于EV71疫苗诱导中和抗体测定的质控；以及低效价EV71 国际参考品（批号：13/238），300 IU/支，作为实验质控品（27）。目前 EV71疫苗抗原国际标准品正在研制中。建议疫苗生产企业依据国家标准品建立用于产品放行质控的参考品或对照品，应注意标准物质标定的可溯源性。

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2.3 生产用原材料
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EV71疫苗生产中应用的种子批、细胞基质，培养基/培养液等原材料的质控标准应符合现行版《中国药典》的相关要求。应使用批准的工作种子批代次生产疫苗。主种子批和工作种子批应测定病毒滴度，疫苗株的主要保护蛋白VP1区核苷酸序列在不同种子批之间应不发生改变，以保证遗传稳定性，免疫原性检测标准为应用１针程序免疫小鼠，中和抗体阳转率应大于80%。应进行无菌检查、支原体检查和外源因子检查，保证无细菌、真菌、支原体及外源因子污染。
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只有经批准的细胞基质才能用于EV71疫苗生产，疫苗生产中应用的细胞基质包括已批准的二倍体和Vero细胞。WHO建议疫苗生产企业尽可能采用150代作为Vero细胞的限定代次（28）。主细胞库至少需进行反转录病毒实验、牛源或猪源病毒检查、致瘤性试验、无菌检查、支原体检查和外源因子检查等，同时应对细胞培养用牛血清的来源进行限定。

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2.4 病毒接种、培养和收获

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取EV71疫苗工作种子批毒种，按规定的MOI接种细胞基质，依据批准的温度、时间培养病毒并收获。单个收获物的储存应在批准的条件和时限内。同一细胞批生产的病毒液合并为病毒收获液。病毒收获液应按照连续生产过程进入后续的纯化处理工艺。样品收获后应立刻进行抽样检定。

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2.5 收获物检定

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收获物的关键检定项目包含病毒滴定、抗原含量和蛋白含量测定，以及无菌检查和支原体检查等项，应分别符合批准的标准。生产企业应提供收获次数中单个生产收获物，以及合并收获物的各自一致性检测数据，并应符合已批准的体现质量一致性的标准。

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2.6 纯化工艺

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应采用批准的工艺进行EV71疫苗抗原的纯化，如色谱柱层析等。纯化的病毒液可进行合并和适当浓缩。纯化病毒液经滤膜过滤即为疫苗原液。当EV71疫苗原液因等待检测结果需暂存时，应依据前期稳定性研究的结果，按批准的保存方式和时间保存。
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2.7 病毒灭活及验证

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应采用批准的经验证的灭活剂和工艺进行EV71病毒的灭活，在限定总蛋白含量下，采用一定浓度的灭活剂，在确定的最佳温度下灭活足够时间，保证EV71病毒得到充分灭活。对每个病毒灭活容器均取样进行病毒灭活验证试验，按规定量，将EV71灭活液接种适宜细胞基质，35～37℃培养5～7天，冻融后同法再盲传２代，显微镜观察每代次应均无CPE。

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2.8 原液检定

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应采用批准的EV71鉴别实验、抗原含量等检测方法对原液和中间产物进行质控。抗原含量的检测多采用ELISA方法，需应用国家抗原标准品进行质控和含量赋值（U），也可自建对照品以监测测定结果的准确性。由于EV71疫苗为铝佐剂吸附疫苗，在成品中受佐剂以及蛋白稀释等因素影响的检定项目需在原液阶段进行。疫苗相关工艺杂质如牛血清白蛋白残留量、Vero 细胞蛋白残留量和DNA残留量，残留添加物如有机溶剂聚乙二醇6000、聚山梨酯80或Triton-X100等，以及非限制性核酸内切酶限度检定均应符合批准的限度。疫苗抗原纯度检测时原液中目标蛋白的纯度应不低于95.0%。应采用适宜的方法测定原液中可能潜在杂质蛋白的含量或比例，如SDS-PAGE或HPLC方法等。应关注抗原降解产物的鉴别和检测，考虑制定可接受的范围。病毒灭活验证试验时，将细胞盲传3代，应不得出现细胞病变。应证明无细菌、真菌、分枝杆菌和支原体污染。

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2.9 半成品配制和检定

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依据每批疫苗按抗原定量配制的要求，基于原液中EV71抗原的测定含量，以及成品疫苗的目标剂量，加入稀释液及氢氧化铝吸附剂，配制成目标剂量的半成品。由于EV71疫苗为铝佐剂吸附产品，半成品检定时除检测无菌、pH和氢氧化铝外，应测定EV71抗原吸附率。

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2.10 成品分装和检定

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依据企业注册标准和现行版《中国药典》进行分装、包装和检定。自建的方法需经批准，应用药典的方法需经过验证。疫苗成品质控项目包括EV71疫苗鉴别实验、外观、装量、无菌检查、细菌内毒素检查和异常毒性等指标；理化项目包括pH，氢氧化铝含量，游离甲醛含量以及渗透压摩尔浓度等指标。细胞培养液中添加抗生素时，需检测成品中抗生素残留量。疫苗的效力测定包括体内效力（ED50）以及体外相对效力，并测定中和抗体应答。疫苗抗原含量和中和抗体水平测定时需应用国家抗原和中和抗体标准品进行质控和赋值。抗原含量或效力测定标准的确定应综合考虑检测方法的误差，半成品配制操作过程中可能存在的偏差，以及成品在有效期内可接受的抗原降解。

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2.11 稳定性评价、储存和有效期

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EV71疫苗为铝佐剂吸附疫苗，具有较好的稳定性。疫苗稳定性评价应依据WHO相关文件和现行版《中国药典》中人用疫苗总论等要求进行（4,29）。稳定性评价的类型包括实时条件下、加速稳定性、极端条件下及热稳定性研究，其中实时条件下稳定性研究为最基本的研究，疫苗获批后生产阶段一般选择在实时条件下的稳定性研究。按照《药品生产质量管理规范》（2010 年修订）中持续稳定性考察要求进行。通常情况下至少每年应当考察一个批次。中间产物稳定性评价目的为确定中间产物储存的条件和时间。成品稳定性评价则是确定疫苗的保持条件和有效期，并保证有效期内疫苗的有效性和安全性。EV71疫苗中间产物和疫苗成品的储存条件和时间应依据批准的标准执行。EV71疫苗为铝佐剂吸附疫苗，严禁冻结，因铝佐剂疫苗遭冻结后将永久性破坏免疫原性。

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3. 疫苗批签发
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疫苗批签发，是指国家食品药品监管部门对预防性疫苗在每批制品出厂上市前或者进口时，由指定的药品检验机构进行审核、检验及签发的制度（30）。我国疫苗批签发主要采用资料审核和样品检验相结合的形式。在批签发过程中，应特别重视对关键质量参数的趋势分析。应用趋势分析可发现某些批次疫苗出现偏差，启动调查并采取措施；考察生产过程中发生的变更对制品的影响（如工作种子批、设备）以及在一定生产周期内疫苗质量的变化趋势。因此疫苗批签发是确定疫苗生产一致性，保证上市疫苗有效性、安全性的必要手段。
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3.1 EV71疫苗批制造及检定记录摘要应包括的主要内容及关键参数

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企业应向批签发药检机构提供每批EV71疫苗的批制造及检定记录摘要。批制造及检定记录摘要应涵盖生产、检定过程中各环节的主要参数、经批准的企业名称、地址，及所生产疫苗的品种、批量和批号等，所提供的信息应确定、并可追溯。注明成品中起始材料、中间产物及半成品各个组分的失效日期；以生产流程图的方式，确认疫苗起始材料、中间产物、半成品和成品的唯一、合理的生产流程，生产流程应能追溯主要组分生产全过程；疫苗生产用毒株、二倍体细胞或Vero细胞基质的名称和代次应与批准的一致；证实疫苗生产工艺及规模、质控检测方法、质量标准，中间产物的批号、批量、保存条件等数据与批准的相同。关键工艺步骤操作参数、关键中间产物检测结果、目的产物收率应在可接受范围内；依据所提供的相关信息确认疫苗中活性组分含量等的理论值和实际值；提供疫苗起始材料、中间产物、半成品和成品的检测结果和质量标准，包括每项检定的结果；应提供检测的起始日期、方法、关键试剂，标准物质、工作参考品和对照品的列表以及相关的制备、标定和稳定性等关键信息。

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3.2 EV71疫苗批签发趋势分析的技术要求

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对EV71疫苗关键中间产物及成品活性成分和杂质的定量检测数据，均应进行趋势分析，如收获液病毒滴度，原液抗原含量、蛋白含量、纯度，成品体外相对效力、体内效力、理化指标以及可定量检测的杂质等项目；对于疫苗质控和检测中所使用的标准物质、工作参考品及对照品也应进行趋势分析。

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生产企业应对EV71疫苗检验的所有关键性定量数据绘制趋势分析图。当疫苗检测批次结果的数量少于40个，应在至少6个连续批检验结果的基础上计算平均值和SD值，每个新的结果可添加并重新计算平均值和SD值。当批次结果数量等于或多于40个时，应根据至少10批不同原液得到最初的40个结果确定平均值和SD值。在其后持续进行趋势分析中不再随新增检验结果重新计算平均值，避免因引入新的检测数据而发生偏移。

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生产企业应确定疫苗质控关键项目趋势分析的警戒限和行动限。当出现1批疫苗检验结果超出行动限，3个连续批疫苗超出警戒限，或趋势有严重漂移，以及连续3至5批疫苗在均值一侧且接近警戒限时，应启动调查，查找分析原因，评估对疫苗质量的影响风险，确定相关批次疫苗是否予以放行，批签发机构依据同样的原则决定是否予以签发。

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应开展标准物质和对照品的趋势分析，目的是为监测EV71疫苗标准物质的活性，以进行检定实验室的质控。包括对应用国家标准物质的测定值，以及对企业用于疫苗质控和检测所自建工作参考品、对照品测定值的趋势分析等，应绘制趋势分析图，规定相应的警戒限和行动限。
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应定期完成疫苗趋势分析和报告。EV71疫苗生产企业和批签发机构分别每半年或一年将各自检测关键项目的数据与前期数据进行比较。需比较批签发机构与生产企业的数据，结果分析时应考虑两者检定时的时间差异。
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4. 起草单位和致谢

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起草单位：中国食品药品检定研究院生物制品检定所肝炎病毒疫苗室
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致谢：提出修改意见的各位专家及 3 家EV71疫苗生产企业

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