ELISA技术综述

ELISA原理
4 A6 @9 f, w9 uELISA利用抗原抗体之间专一性结合之特性，对标本进行检测；由于结合与固体承载物（一般为塑胶孔盘）上之抗原或抗体仍可具有免疫活性，因此设计 其结合 机制後，配合酵素显色反应，即可显示特定抗原或抗体是否存在，并可利用显色之深浅进行定量分析。根据待测样品与结合机制的不同，ELISA可设计出各种不 同类型的检测方式，主要以"三明治法"(sandwich)、"间接法"(indirect)、以及"竞争法"(Competitive)三种为主，以下 为各种方法之介绍。
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ELISA分类
' ?& |% _8 L. b9 \" |  N1 `$ p见ELISA的双抗夹心法原理；
ELISA的双抗夹心法，又称"三明治法"。
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三明治法常用于检测大分子抗原，一般之操作步骤为：
1 w' x$ [% {) u6 u" W9 _将具有专一性之抗体固着(coating)于塑料孔盘上，完成後洗去多馀抗体；
加入待测标本，标本中若含有待测之抗原，则其会与塑料孔盘上的抗体进行专一性结合；
  E, f5 V5 D: N' i& G洗去多馀待测标本，加入标记有酵素之二次抗体，与抗原结合；
' J+ u* k: \$ v# Z% p! {/ i洗去多馀未结合的二次抗体，加入酵素受体使呈色，以肉眼或仪器读取显色结果。
三明治法分别以两种抗体对标本中的抗原进行两次专一性辨认，因此专一性相当高，但此待测抗原必须是多价抗原，如此才可获得两种以上的专一性抗体，以分别进行夹心；而且此法需要足够的表位空间以进行抗原抗体的夹心，所以并不适用于半抗原或小分子抗原等分子量较小之标的。
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9 q9 ]+ F. Q' h' k# S7 CELISA双抗夹心法的衍生方法如ABC法：ELISA的生物素 -亲和素系统，该产品系列是检测方法上的重要革命。生物素/亲和素系统用于ELISA一般有三种形式，即桥联法（BAB）、标记法 （BA）和ABC法，不少学者用之检测了不同的抗原—抗体系统均取得了较好的结果，其中以BA法和ABC法应用较多，敏感性一般比常规ELISA法高 4～80倍。

所谓ABC技术是指Avidin : Biotinylated Enzyme Complex Technology，亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术，所谓的ABC系统，被普遍视为目前最灵敏、最可靠与最有效的染色系统，并被广泛应用于免疫 组织化学、免疫电镜、原位杂交与凝集素化学中。而该系统仍在不断地发展，以满足广大研究人员的各种不同要求（如多抗原的标记检测）。


ELISA的间接法：

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- P* k6 q* [. }7 k5 ]9 P间接法常用于检测抗体，一般之操作步骤为：
将已知之抗原固着于塑胶孔盘上，完成後洗去多馀之抗原；
1 K: p- F+ L* m! b! }) ?加入待测标本，标本中若含有待测之一次抗体，则其会与塑胶孔盘上的抗原进行专一性结合；
* E( h/ V% @" Z. Y洗去多馀待测标本，加入带有酵素之二次抗体，与待测之一次抗体结合；
3 M9 w9 q7 Y$ n- [; y$ r9 _0 C* [洗去多馀未结合的二次抗体，加入酵素受体使酵素显色，以肉眼或仪器读取显色结果。


ELISA的竞争法原理；
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9 ~1 @! w  s  q7 I竞争法是一种较少用到的ELISA检测机制，一般用于检测小分子抗原，其操作步骤为：
将具有专一性之抗体固着于塑胶孔盘上，完成後洗去多馀抗体；
0 @$ x4 E, U7 i* M6 ]4 X4 r9 D加入待测标本，使标本中的待测抗原与塑胶孔盘上的抗体进行专一性结合；
加入带有酵素之抗原，此抗原也可与塑胶孔盘上的抗体进行专一性结合，由于塑胶孔盘上固着的抗体数量有限，因此当标本中抗原的量越多，则带有酵素之抗原可结合的固着抗体就越少，亦即，两种抗原皆竞相与塑胶孔盘上抗体结合，即所谓竞争法之由来。
0 ^0 }$ L4 \4 c$ y( n洗去标本与带有酵素之抗原，加入酵素受体使酵素显色，当标本中抗原量越多，代表塑胶孔盘内留下的带有酵素的抗原越少，颜色也就越浅。
0 n5 O% \$ O! G/ L! X3 n当需要检测无法获得两种以上单一性抗体的抗原，或是不易得到足够的纯化抗体以固着在塑胶孔盘上时，一般会考虑使用竞争法ELISA。
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7 I! s# ?- \% f: D: NELISA的商品化试剂盒成分和分类：
在临床检验或者科研检测中，ELISA 实验通常有商品试剂盒提供。ELISA试剂盒中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物等。
完整的ELISA试剂盒包含以下各组分：（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；
（2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；
（3）酶的底物；
（4）阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参考标准品和控制血清（定量测定中）；
! r+ w1 B4 @" i: o8 g; y& z, s0 P（5）酶联物（结合物）及标本的稀释液；
（6）洗涤液；
（7）酶反应终止液。


1、免疫吸附剂
; d- j) r3 I" e. B已包被抗原或抗体的固相载体在低温（2~8℃）干燥的条件下一般可保存6个月以上。有些不完整的试盒，仅供应包被用抗原或抗体，检测人员需自行包被。如BioTNT 网站中，代理的产品，有的是complete的试剂盒，有的是需要再进行包被的duoset，或者是其他的说法，都是不完整的试剂盒。

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, ~0 F: \$ E5 I" r2 l4 D1.1 固相载体
固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反应。可作ELISA中载体的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯 乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性，加之它的价格低廉，所以被普遍采用。聚苯乙烯为塑料，可制成各种形式。

ELISA载体的形状主要有三种：微量滴定板、小珠和小试管。以微量滴定板最为常用，专用于EILSA的产品称为ELISA板，国际上标 准的微量滴定板为8×12的96孔式。为便于作少量标本的检测，有制成8联孔条或12联孔条的，放入座架后，大小与标准ELISA板相同。ELISA板的 特点是可以同时进行大量标本的检测，并可在特制的比色计上迅速读出结果。现在已有多种自动化仪器用于微量滴定板型的ELISA检测，包括加样、洗涤、保 温、比色等步骤，对操作的标准化极为有利。聚苯乙烯经射线照射后，其吸附性能特别是对免疫球蛋白的吸附性能增加，应用于双抗体夹心法可使固相上抗体量增 多，但用于间接法测抗体时空白值较大。


良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔 之间性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工艺的差别，各种产品的质量差异很大，因此，每一批号的ELISA板在使用前须事先检查其性能。 常用的检查方法为：以一定浓度的人IgG（一般为10ng/ml）包被ELISA板各孔，洗涤后每孔内加入适当稀释度的酶标抗人IgG抗体，保温后洗涤， 加底物显色，终止酶反应后，分别测每孔溶液的吸光度。控制反应条件，使各孔读数在吸光度0.8左右。计算全部读数的平均值。所有单个读数与全部读数的均数 之差，应小于10%。

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% U: K2 r) r# B  q! ]1 f与聚苯乙烯类似的塑料是聚氯乙烯。作为ELISA固相载体，聚氯乙烯的特点为质软板薄，可剪割，价廉，但光洁度不如聚苯乙烯板，孔底亦不如聚苯乙烯平整。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。

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2 `" i9 ~# R7 k为比较不同固相在某一ELISA测定中的优劣，可应用如下的试验：用其他免疫学测定方法选出一个典型的阳性标本和阴性标本，将它们进行一系列稀释后，在 不同的固相载体上按预定的ELISA操作步骤进行测定，然后比较结果。在哪一种载体上阳性结果与阴性结果差别最大，这种载体就是这一ELISA测定项目的 最合适的固相载体。

) m! W9 ~/ `- q. S; X4 }在ELISA中，用作固相载体的小珠一般为直径0.6cm的圆珠，表面经磨砂处理后吸附面积大大增加。ELISA板孔的吸 附面积约为200mm2，小珠均为1000mm2，将近ELISA板孔的5倍。吸附面积的增大即意味着固相抗原或抗体量的增加。再者，球型小珠的表面弧度 更有利于吸附的抗原决定簇或抗体结合位点的暴露面处于最佳反应状态，因此珠式ELISA的反应往往更为灵敏。小珠的另一特点是更易于使洗涤彻底，使用特殊 的洗涤器，使小珠在洗涤过程中滚动淋洗，其洗涤效果远较板孔的浸泡式为好。但由于磨砂工艺的难度较大，小珠的均一性较差。


小试管作为固相载体也有较大的吸附表面，而且标本的反应量也相应增加。板式及珠式ELISA的标本量一般为00-200ul，而小试管可根据需要加大反应体积，标本反应量的增加有助于试验敏感性的提高。小试管还可以当作比色杯，最后直接放入分光光度计中比色。
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6 T8 t) V, ]# T6 q  [也有应用聚苯乙烯胶乳或其他材料制成的微粒作为ELISA固相载体的。其优点是表面积极大，反应在悬液中进行，其速率与液相反应近似。以含铁的磁性微粒作为ELISA固相载体，反应后用磁铁的吸引进行分离，洗涤方便，试剂盒一般均配以特殊仪器。

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3 u: n0 X9 f6 I+ l% \应用于科研领域，定量检测的试剂盒，对固相载体的要求比较高，一般采用nunc 或者costar，或者其他知名品牌的酶标板，来进行包被。
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% ~( Z3 Y  s* Q0 Z  Q3 w5 B( A以下简述固相载体和包被过程。
1.2 包被的方式
将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)。换言之，包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面的过程。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合 的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用力。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。载体对 不同蛋白质的吸附能力是不相同的，大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。IgG对聚苯乙烯等固相具有较强的吸附 力，其联结多发生在Fc段上，抗体结合点暴露于外，因此抗体的包被一般均采用直接吸附法。蛋白质抗原大多也可采用与抗体相似的方法包被。当抗原决定簇存在 于或邻近于疏水区域时，抗原与固相载体的直接吸附可使抗原决定簇不能充分暴露，在这种情况下，直接包被效果不佳，可以采用间接的捕获包被法，即先将针对该 抗原的特异抗体作预包被，其后通过抗原抗体反应使抗原固相化。此间接结合在固相上的抗原远离载体表面，其抗原决定簇也得以充分暴露。间接包被的抗原经固相 抗体的亲和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法，试验的特异性、敏感性均由此得以改善，重复性亦佳。间接 包被的另一优点是抗原用量少，仅为直接包被的1/10乃至于/100。不易吸附在聚苯乙烯载体上的非蛋白质抗原可采用特殊的包被方式。例如，在检测抗 DNA抗体时，需用DNA作为包被抗原，而普遍的固相载体一般不能直接与核酸结合。可将聚苯乙烯板先经紫外线照射（例如30W紫外灯，75cm照射12小 时），以增加其吸附性能。固相载体先用碱性蛋白质，如聚赖氨酸、鱼精蛋白等作预包被，也可提高核酸的结合力。也可用亲和素生物素系统作间接包被，即用亲和素先包被载体，然后加入生物素化的DNA，这种包被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。

# K; Z( ]3 ]& Q8 T! U6 V" ?, L脂类物质无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。抗心磷脂抗体的ELISA试剂一般采用这种包被方式。
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1.3 包被用抗原
用于包被固相载体的抗原按其来源不同可分为天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。天然抗原可取自动物组织、微生物 培养物等，须经提取纯化才能作包被用。如HBsAg可以从携带者的血清中提取，一般的细菌和病毒抗原可以从其培养物中提取，蛋白成份抗原可从富含此抗原的 材料中提取等（例如AFP从脐带血或胎肝中提取）。重组抗原是抗原基因在质粒体中表达的蛋白质抗原，多以大肠杆菌或酵母菌为质粒体。重组抗原的优点是除工 程菌成份外，其他杂质少，而且无传染性，但纯化技术难度较大。以大肠杆菌为质粒体的重组抗原如不能充分除大肠杆菌成份，用于ELISA，在反应中可出现假 阳性，因不少受检者受大肠杆菌感染而在血清中存在抗大肠杆菌抗体。重组抗原的另一特点是能用基因工程制备某些无法从天然材料中分离的抗原物质。例如丙型肝 炎病毒（HCV）尚不能培养成功，而且丙肝病人血清中HCV抗原含量极微。目前检测抗HCV ELISA中所用包被抗原大多为根据HCV的基因克隆表达而 制备的重组抗原。在传染病诊断中，不少重组抗原如HBsAg、HBeAg和HIV抗原等均在ELISA中取得应用。合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分子的某 一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。多肽抗原一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。多肽抗原的包被一般需先使其与无关蛋白质如牛血清白蛋白质（BSA）等偶联，借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。应用多肽抗原的另一 注意点为他仅能检测与其相应的抗体。一种蛋白质抗原往往含有多个不同的能引起抗体产生的决定簇，因此在受检血清中的其他抗体就不能与该多肽抗原发生反应。 另外，某些微生物发生变异时往往发生抗原结构变化，在这种情况下，用个别多肽抗原进行包被可引起其他抗体的漏检。

. K, V$ S) y% {) m2 d1.4 包被用抗体
, Q$ w, r" ^3 Q/ C* R, W包被固相载体的抗体应具有高亲和力和高特异性，可取材于抗血清或含单克隆抗体的腹水或培养液。如免疫用抗原中含有杂质（即便是极微量的），在抗血清中将 出现杂抗体，必须除去（可用吸收法）后才能用于ELISA，以保证试验的特异性。抗血清不能直接用于包被，应先提取IgG，通常采用硫酸铵盐析和 Sephadex凝胶过滤法。一般经硫酸铵盐析粗提的IgG已可用于包被，高度纯化的IgG性质不稳定。如需用高亲和力的抗体包被以提高试验的敏感性，则 可采用亲和层析法以除去抗血清中含量较多的非特异性IgG。腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作吸收和亲和层析处理，一般可将腹水作适当稀 释后直接包被，必要时也可用纯化的IgG。应用单抗包被时应注意，一种单抗仅针对一种抗原决定簇，在某些情况下，用多种单抗混合包被，可取得更好的效果。
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1.5 　包被的条件
包被用抗原或抗体的浓度，包被的温度和时间，包被液的pH等应根据试验的特点和材料的性质而选定。抗体和蛋白质抗原一般采用pH9.6的碳酸盐缓冲液作 为稀释液，也有用pH7.2的磷酸盐缓冲液及pH7~8的Tris-HCL缓冲液作为稀释液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放 置过夜，37℃中保温2小时被认为具有同等的包被效果。包被的最适当浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选 定。一般蛋白质的包被浓度为100ng/ml-20ug/ml。
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& Q% j7 v- G8 ?$ w1.6 封闭
封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无 关蛋白质溶液再包被的过程。抗原或抗体包被时所用的浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排 斥在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。封闭的手续与包被相类似。最常用的封闭剂是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血清或 1%明胶作为封闭剂的。脱脂奶粉也是一种良好的封闭剂，其最大的特点是价廉，可以高浓度使用（5%）。高质量的速溶食用低脂奶粉即可直接当作封闭剂使用， 但由于奶粉的成份复杂，而且封闭后的载体不易长期保存，因此在试剂盒的制备中较少应用。
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& l/ d* G3 t0 u7 H2 W: f3 x封闭是否必要，取决于ELISA的模式及具体的实验条 件。并非所有的ELISA固相均需封闭，封闭不当反而会使阴性本底增高。一般说来，双抗体夹心法，只要酶标记物是高活性的，操作时洗涤彻底，不经封闭也可 得到满意的结果。特别是用单抗腹水直接包被时，因其中大量非抗体蛋白在包被时同样也吸附在固相表面，业已起到了类似封闭剂的作用。但在间接法测定中，封闭 一般是不可少的。包被好的ELISA板干燥后放入密封袋或锡袋中，在低温可保存数月。


' C6 n$ b* C! A" f, }8 B0 i2.   酶联物（结合物）
4 }" _3 B5 V9 B: T- D; x结合物即酶标记的抗体（或抗原），是ELISA中最关键的试剂。良好的结合物应该是 既保有酶的催化活性，也保持了抗体（或抗原）的免疫活性。结合物中酶与抗体（或抗原）之间有恰当的分子比例，在结合试剂中应尽量不含有或少含有游离的（未 结合的）酶或游离的抗体（或抗原）。此外，结合物尚要有良好的稳定性。
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2.1   酶
用于ELISA的酶应符合以下要求：纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来源丰富，价格不贵，制备成酶结合物后仍继续保留它的活性部分和催化能力。最好在受检标本中不存在相同的酶。另外，它的相应底物易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定等。
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) G3 K2 b  T$ b8 h$ _( W在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和碱性磷酸酶 (alkaline phosohatase, AP)。在少数商品ELISA试剂中，应用的酶尚有葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。国产 ELISA试剂一般都用HRP制备结合物。HRP是一种糖蛋白，含糖量约为18%，分子量为44000，是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红 素）结合而成，是一种卟啉蛋白质。主酶无色糖蛋白在275nm波长处有最高吸收峰，辅基是深棕色的含铁卟啉环，在403nm波长处有最高吸收峰。HRP的 纯度用RZ(Reinheit Zahl，德文，意为纯度数）表示，是403nm的吸光度与280nm吸光度之比，高纯度的HRP的RZ≥?.0。
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HRP除符合上述的ELISA中标记酶的要求外，更有价格低廉和性质较稳定的特点。值得注意的是，在选用酶制剂时，除其纯度RZ外，更应注意酶的活力。 高纯度的酶如保存不当，活力也会降低。酶制剂的活力以所含的酶活力单位表示，可用对底物作用后生成产物量的测定进行试验。

2 h- k7 K! E8 [& _) Y; i0 B国外很多ELISA 试剂采用碱性磷酸酶（AP）作为标记酶。常用的AP有两个来源，分别从大肠杆菌和小牛肠膜中提取。不同来源的酶生化特性特性略不相同，从大肠杆菌中提取的 AP分子量为80000，酶作用的最适合pH为8.0；用小牛肠膜中提取的AP分子量为100000，最适pH为9.6。在ELISA中，AP系统的敏感 度一般高于HRP系统，空白值也较低，但AP价格昂贵，制备结合物所得率也较HRP低。

2 .2  抗原和抗体
3 S6 a' r1 y9 K3 C. T' J  R制备结合物时所用抗体 一般 均为纯度较高的IgG，以免在与酶联结时其他杂蛋白的干扰。最好用亲和层析纯的抗体，这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释度进行反 应，实验结果本底浅淡。如用F(ab')2进行标记，则更可避免标本中RF的干扰。在ELISA中用酶标抗原的模式不多，总的要求是抗原必须是高纯度的。

2.3  结合物的制备
酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。
- q; ~1 F) d7 k# ]（1）戊二醛交联法：戊二醛是一种双功能团试剂，它可以使酶与蛋白质的氨基通过它而联结。碱性磷酸一般用此法进行标记。交联方法一步法、两步法两种。在一步法中戊二醛直接加入酶与抗体的混合物中，反应后即得酶标记抗体。
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- V0 s3 e' i) hELISA中常用的酶一般都用此法交联。它具有操作简便、有效（结合率达60%-70%）和重复性好等优点。缺点是交联反应是随机的，酶与抗体交联时分 子间的比例不严格，结合物的大小也不均一，酶与酶，抗体与抗体之间也有可能交联，影响效果。诹讲椒ㄖ校?br> 先将酶与戊二醛作用，透析除去多余 的戊二醛后，再与抗体作用而形成酶标抗体。也可先将抗体与戊二醛作用，再与酶联结。两步法的产物中绝大部分的酶与蛋白质是以1:1的比例结合的，较一步法 的酶结合物更有助于本底的改善以提高敏感度，但其偶联的有效率较一步法低。

（2）过碘酸盐氧化法：本法只适用于含糖量较高的酶。辣根过氧化物 酶的标记常用此法。反应时，过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基很活泼，可与蛋白质上的氨基形成Schiff氏碱而结合。酶标记物按克分子比例联 结，其最佳比例为：酶/抗体=1-2/1。此法简便有效，一般认为是HRP最可取的标记方法，但也有人认为所有试剂较为强烈，各批实验结果不易重演。
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按以上方法制备的酶结合物一般都混有未结合物的酶和抗体。理论上，结合物中混有的游离酶一般不影响ELISA中最后的酶活性测定，因经过彻底洗涤，游离 酶可被除去，并不影响最终的显色。但游离的抗体则不同，它会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，从而减少了结合到固相上的酶标抗体的量。因此制备的酶结合物应 予纯化，去除游离的酶和抗体后用于检测，效果更好。纯化的方法很多，分离大分子化合物的方法均可应用。硫酸铵盐析法最为简便，但效果并不理想，因为此法只 能去除留在上清中的游离酶，但相当数量的游离抗体仍与酶结合物一起沉淀而不能分开。用离子交换层析或分子筛分离更为可取，高效液相层析法可将制备的结合物 清晰地分成三个部分：游离酶、游离抗体和纯结合物而取得最佳的分离效果，但费用较贵。
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$ T& d$ L* l4 w7 S! O3 d结合物制得后，在用作ELISA试剂前尚需确定其适当的 工作浓度。使用过浓的结合物，既不经济，又可使本底增高；结合物的浓度过低，则又影响检测的敏感性。所以必须对结合物的浓度予以选择。最适的工作浓度就是 指结合物稀释至这一浓度时，能维护一个低的本底，并获得测定的最佳灵敏度，达到最合适的测定条件和测定费用的节省。就酶标抗体本身而言，它的有效工作浓度 是指与其相应抗原包被的载体作试验时，能得到阳性反应的最高稀释度。例如某一HRP：抗人IgG制剂标明的工作浓度为1:5000，表示该制剂经 1:5000稀释后，在与人IgG包被的固相作ELISA试验时，将发生阳性反应。但在用于具体的ELISA检测中，酶标抗体的最适工作浓度受到固相载体 的性质、包被抗原或抗体的纯度以及整个检测系统如标本、反应温度和时间等的影响，因此必须在实际测定条件下进行"滴配"选择能达到高敏感度的最大稀释度作 为试剂盒中的工作浓度。

4 a' m# E, z6 x1 M) B2 D8 h2.4 　结合物的保存
酶标抗体中的酶和抗体均为生物活性物质，保存不当，极易失活。高浓度的结合物较为稳 定，冰冻干燥后可在普通冰箱中保存一年左右，但冻干过程中引起活力的减低，而且使用时需经复溶，颇为不便。结合物溶液中加入等体积的甘油可在低温冰箱或普 通冰箱的冰格中较长时间保存。早期的ELISA试剂盒中的结合物一般均按以上两种形式供应，配以稀释液（见3.2.5）临用时按标明的稀释度稀释成工作 液。现在较先进的ELISA试剂盒均已用合适的缓冲液配成工作液，使用时不需再行稀释，在4-8℃保存期可达6个月。由于蛋白质浓度较低，结合物易失活， 需加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素（例如庆大霉素）和防腐剂（HRP结合物加硫柳泵，AP结合物可加叠氮钠），以防止细菌生长。
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2.5 　结合物的稀释液
用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上，在稀释缓冲液中常加入高浓度的无关蛋白质（例如1%牛血清白蛋白）， 通过竞争以抑制结合物的吸附。一般还加入具有抑制蛋白质吸附于塑料表面的非离子型表面活性剂，如吐温20，0.05%的浓度较为适宜。在间接测定抗体时， 血清标本需稀释后进行测定，也可应用这种稀释液。
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, w0 j" o/ S& V( i0 z- E) a: Q$ ?3. 酶的底物
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3.1HRP的底物
: ^4 H. b; H& K5 s# z6 D+ LHRP催化过氧化物的氧化反应，最具代表性的过氧化物为H2O2，其反应式如下：
$ D1 P' m# `5 U8 z0 ]; m7 {3 {1 L1 }" {DH2+ H2O2 D+ H2O
: G6 p6 w1 k5 P# {% c* x6 y上式中，DH2为供氧体，H2O2为受氢体。在ELISA中，DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物，以便作比色测定。常用的供氢体有邻苯 二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基联苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)和 ABTS[2,2'-azino-di-(3-ethylbenziazobine sulfonate-6)]。
OPD氧化后的产物呈橙红 色，用酸终止酶反应后，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用的底物。OPD本身难溶于水，OPD·2HCL为水溶性。 曾有报道OPD有致异变性，操作时应予注意。OPD见光易变质，与过氧化氢混合成底物应用液后更不稳定，须现配置现用。在试剂盒中，OPD和H2O2一般 分成二组分，OPD可制成一定量的粉剂或片剂形式，片剂中含有发泡助溶剂，使用更为方便。过氧化氢则配入底物缓冲液中，有制成易保存的浓缩液，使用时用蒸 馏水稀释。先进的ELISA试剂盒中则直接配成含保护剂的工作浓度为0.02% H2O2的应用液，只需加入OPD后即可作为底物应用液。

/ a$ W" g3 p* k  d. ?, p$ ]9 oTMB经HRP作用后共产物显蓝色，目视对比鲜明。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液，可直接作底物使用。另 外，TMB又有无致癌性等优点，因此在ELISA中应用日趋广泛。酶反应用HCL或H2SO4终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸 收波长为405nm。
ABTS虽不如OPD和TMB敏感，但空白值极低，也为一些试剂盒所采用。
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- _6 s& i& y. Q% H$ S7 d1 {另一种HRP的底物为3-(4-羟基)苯丙酸[3-(4-hydroxy)phenly propionic acid,HPPA]，经HRP作用后，产物显荧光，可用荧光光度计测量。用于ELISA的优点为可加宽定量测定的线性范围。
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HRP对氢受体的专一性很高，仅作用于H2O2、小分醇的过氧化物和尿素过氧化物(urea peroxide)。H2O2应用最多，但尿素过氧化物为 固体，作为试剂较H2O2方便、稳定。试剂盒供应尿素过氧化物片剂，用蒸馏水溶解后，在底物缓冲液中密闭、低温（2～8℃）可稳定1年。
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3.2　AP的底物
# I3 f  h5 M" i& z8 v, KAP为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-NPP)作为底物，可制成片剂，使用方便。产物为黄色 的对硝基酚，在405nm波长处有吸收峰。用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一时间。AP也有发荧光底物（磷酸4-甲基伞酮），可用于ELISA作荧光 测定，敏感度较高于用显色底物的比色法。
4.     洗涤液
在板式ELISA中，常用的稀释液为含0.05%吐温20磷酸缓冲盐水。

5.     酶反应终止液
. c: X" U3 ]% R6 v常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板式ELISA中一般采用2mol/L。

3 \9 c' K# ^  U6.    阳性对照品和阴性对照品
1 E  t4 L0 I0 }; ~3 j& `阳性对照品(positive control)和阴性对照品(negative control)是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的对 照，因此对照品，特别是阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致。以人血清为标本的测定，对照品最好也为人血清，因为正常人血清在各种 ELISA模式中可产生不同程度的本底。由于大量正常人血甭较难得到，国外试剂盒中的对照品多以复钙人血浆 (recalcified human plasma)为原料，即在血浆中加入钙离子，使其中的纤维蛋白质凝固，除去凝块后所得的液体，其组成与血清相 似。阴性对照品须先行检测，确定其中不含待测物质。例如HBsAg检测的阴性对照品中不可含HBsAg，最好抗HBs也是阴性。阳性对照品多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质，其中加入一定量的待检物质，此量最好在试剂说明书中标明。加入的量应与试剂的敏感度相称，在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较， 可对标本中受检物质的量有一个粗略的估计。国外检测HBsAg的ELISA试剂盒检测敏感度约为0.5ng/ml，阳性对照品中含量约为10ng/ml。 在对照品中一般加入抗生素和防腐剂，以利保存。

: F" Y+ B( r) J9 H" i4 H" u  a7.    参考标准品
定量测定的ELISA试剂盒（例如甲胎蛋白质癌胚抗原测定等）应含有制作标准曲线用的参考标准品，应包括覆盖可检测范围的4-5个浓度，一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中。

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其他内容：
1 ~4 O! r- ?4 e9 v; E* Y  e! k) P' X酶联免疫测定技术的多酶级联放大系统：

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一、AP底物放大系统
substrate ampiification system
AP可催化底物NADP+脱磷酸而生成NAD+(辅酶1)，以乙醇作还原剂，在醇脱氧酶催比下，乙醇脱氢，NAD+还原为NADH，NADH在黄递酶的催 化下脱氢，同时四唑盐(tetrazoliim)被还原成有色的甲蜡(formazan)。AP不断催化NAD+生成，NAD+与NADH循环转化，不断 生成甲蜡。整个反应周期由AP及醇脱氢酶、黄递酶组成酶级联，每个AP分子每分钟可催化生成6X104个NAD+分子，而每个NAD+每分钟又可使60个 甲腊分子产生。这种由Selfl984年首次报道的EIA放大系统可使EIA的测定敏感性提高约250倍。


6 G0 G8 h3 m- D但Brooks等发现上述底物反应循环中产生的乙醛对整个酶级联反应有抑制作用，影响放大效果，而当加入盐酸氨基脲时，则可进一步延长反应循环，从而增加 测定敏感性，这是因为盐骏氨基脲可与乙醛反应生成缩氨基脲(semicarbatone)和水，这样就消除了乙醛对反应的抑制阼用。应用这种改进方法测定 食物中含蛋白A的金黄色葡萄球菌，测定敏感性从Self原方法的(4～6)X103菌落形成单位(c．{．u)/g或m1，到20个菌落形成单位 (c．f．u)/g或ml，测定敏惑性约提高200—300倍。


后来Self等又用刃天青(resazurin)代替其原来放大模式中的四唑盐，刃天青在黄递酶的作用下成为发出荧光的resorufin，然后使用荧光比色计测定得到结果。这种方式的测定敏感性也较原始方法大为提高，每孔内仅含约350个AP分子也可测出。
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二、双酶级联放大系统
- K* H. s6 ?" Z- s' f$ qdual-enzyme cascade双酶级联放大系统又称酶抑制级联放大系统，酯酶抑制剂4—(3—氧—4，4，4—三氟丁基)苯磷骏盐因其带有封闭性—P04基团，对酯酶不具抑制活性，但 当其在AP作用下脱—PO4基时，失活的抑制剂即成为具活性的抑制剂，使加入的羧酸酯酶失活，通过显色反应测定残留的酯酶活性即可知原始AP的活性，二者 成反比相关。这种放大系统的测定敏感性较普通方法可提高约125倍。
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三、酶激活级联放大系统
3 a) A. h0 ^# w- p$ _3 W5 Y8 T% }enzymeactivationcascade这亦是一种以AP为标记酶的放大系统。黄素—腺嘌呤二核苷酸磷酸(FADP)在AP的催化下脱磷酸为FAD，FAD则使脱辅基的氨基酸氧化酶转化为全酶的 氨基酸氧化酶，后者催化晡氨酸生成H2O2，于是在DCHBS，4AAP及HRP存在下，得到有色产物。上述放大系统可测定l{mol/LAP。

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' s1 B( J$ Z& y& o此外，催化指示物沉着(catalyzedreporterdeposition，CARD)也是一种多酶级联EIA放大系统。HRP氧化生物素或荧光素 标记的酪胺所产生的游离基，可与固相上蛋白的酪氨酸、色氨酸反应而使大量的生物素或荧光素沉着于固相上HRP周围的区域内，沉着的生物素可用HRP及6— 半乳糖苷酶或AP标记的链霉亲合素测定，沉着的荧光素则可用酶标抗荧光素测定。这样使得一分子HRP转化为大量的标记物，从而大为改善(约30倍)EIA 的测定敏感性。Diamandis等使用螯合的Eu3+链霉亲合素—甲状腺球蛋白试剂替代上述酶标物测定AFP，不但提高了测定敏感性，而且也使背景“噪 声”较普通方法改善了6～8倍。我们将上述CARD放大系统直接用于HBsAg商品ELISA试剂盒，在不改变商品试剂盒任何成分和操作步骤的情况下，可 将试剂盒的测定敏感性提高约5倍。

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! c7 Q. S# e$ l/ {& W四、凝固因子酶级联放大系统
脂多糖(1ipopolysaccharide，LPS)可激活鲎血细胞裂解物的凝固级联反应。首先LPS使因子C激活为C，后者又激活因子B为B，B使 前凝固酶转化为凝固酶，凝固酶则催化底物(Boc-Le，u-Gly-Arg-p)产生有色的对硝基苯胺(旷 nitroa·niline，PNA)，A405nm测定。因此，在免疫测定中，如以LPS作为标记物标记抗体，则可通过上述反应使测定敏感性放大，可检 出10-7～10-11g／m1的IgG和10-7～10-11g／ml的抗IgG，Seki等将上述方法用于双夹心法检测HBsAg，敏感性达 10-10～10-12g／ml。


五、免疫复合物转移两位点酶免疫试验
4 C: y& |: s& N, y! {一般来说，在酶免疫测定中，限制测定敏感性的一个重要因素是非特异地结合于固相的标记酶的显色反应，因其会使背景显色加深，从而掩盖了低浓度待测物所致的 特异显色，解决这个问题提高测定敏感性的一条途径是将待测物——抗体—酶复合物从固相上洗提至另一个固相，使用一双标抗体[如生物素和二硝基苯(DNP) 标记的抗体]和一酶标抗体即可达到这个目的，在液相中形成的免疫复合物(双标抗体：抗原：抗体：酶)捕获于DNPIgG包被的聚苯烯珠上，洗涤后，使用二 硝基苯—L—赖氨酸将其从固相上取代下来，然后再将上述免疫复合物捕获于链霉亲合素包被的聚苯烯珠上，最后进行酶反应显色测定。Hashida和 shikawa使用该方法测铁蛋白敏感性达到1zeptomole(1X10-21mol，约600个分子)，较常规方法提高了30倍。众多的研究者用该 方法测定抗甲状腺球蛋白IgC及抗HTLV—1 IgG和抗HIV-1 IgG，敏感性均远远地超过常规方法，取得了良好的效果。
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& ^4 L; m1 R4 B6 j3 M, z! v7 i此外，Domingo和Marco等在进行点免疫结合试验时，以4—氯—1—萘酚作为HRP的底物，反应后得到的不可溶产物因其具有特殊的紫外吸收及荧光 幻灭特征而可在紫外灯下观察结果。由于沉着于膜上的物质是HRP反应的中间产物，而非可见光下能见到的最终产物，所以可大幅度地提高这种固相免疫测定的敏 感性，较常规方法约增加100倍。至于酶脂质体放大系统(1iposomeamplificationsystem)，也是一种新型高效的EIA测定放大 系统。


3 ]% y  E# e5 M; E综上所述，EIA测定放大方式虽然多种多样，且不断推陈出新，但研究者的出发点无非是一方面极力降低影响测定敏感性的非特异显色，如通过 增加操作步骤而达到上述目的的免疫复合物转移两位点酶免疫试验；另一方面则是通过质量提高的信号，从而达到提高敏感性的目的，如增加反应层次的生物素—亲 合素，多酶级联等放大系统。但严格地讲，真正称得上是EIA测定放大系统的仅限于后者，前者还只能说是一种所谓的超敏感 EIA(uhrasensitive enzyme immunoassay)。至于利用酶反应产物特征改变检测手段(如发光或荧光检测)而使EIA测定敏感性提高，则只不过是依靠仪器开阔了“视野“而已。


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