仿制药研发中有关物质研究思路

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伴云 发表于 2014-8-23 23:06:24 | 只看该作者回帖奖励

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上海市食品药品检验所谢沐风撰写
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仿制药研发中有关物质研究思路之我见
—— 暨如何科学客观地评价有关物质
谢沐风
上海市食品药品检验所  上海市浦东新区张衡路1500号
邮编：201203  邮箱：xiemufeng@sina.com
摘要：本文详尽阐述了进行仿制药研发时有关物质研究思路，并针对目前业内出现的一些研发现状，
提出了更为深刻的诠释与理性的观点。同时，从宏观角度解读了药物临床使用时杂质的副作用。
关键词：仿制药研发；有关物质；药物评价；不良反应
现今，有关物质研究已成为仿制药研发的“重中之重”。我国自2007年修订《药品注册管
理办法》以来，国家药品审评中心（以下简称“中心”）发布了大量“有关物质研究指导原则/指
南/电子刊物”等，且该研究也已成为中心较之前评审而言、提高最为显著的一项指标要求、一
个技术“门槛”。同时，各国药典、进口质量标准也对有关物质制订了翔实、充分的质控指标。
再者，前些年国内注射剂不良反应/药害事件层出不穷，众人也将杂质归结为主要因素之一。
所以，在以上背景下，杂质研究成为了近些年业内关注的“焦点与热点”。
但由于专业认知上的局限与偏颇，导致目前业内在进行仿制药研发、药物品质评价、质
量标准提高/修订等时，过分地强调此项研究，陷入“研发过度、用力过猛”的状态，甚至不乏
出现“上天入地、走火入魔”之现象，造成大量人力、物力、财力与时间上的徒劳。
鉴于以上原因，本人在总结多年审评仿制药研发资料的经验、长期从事药品检验的切身
感受、以及药品品质评价法与临床疗效间的相关认知等基础上撰写了此文。以期能为业内有
关物质研究与评价中出现的“刻舟求剑”之窘境提供一些科学理性思路与哲学客观理念，从而
将有限资源用到实处，并愿与众人研讨共进。
（注：文中杂质和有关物质皆指有机杂质，不包括无机杂质和残留溶剂等）
一、质量标准中制订有关物质检查项的原则
研发时均需进行有关物质研究（除非主成分为无机物），根据研究结果酌情制订质量标准。
1. 原料药质量标准
通常需制订。即便该原料药稳定性良好，在效期内杂质无任何增加/变化，质量标准中也
应制订有关物质检查项。此举是为保证今后生产过程中，通过对合成工艺杂质的控制与评估，
来保证批间原料药生产稳定性与质量均一性。
2. 制剂质量标准
研发时应研究“原料药制成0天制剂”和“0天制剂在效期内流通（或经加速试验）”这两个
环节的杂质变化情况。只要一个环节有变化（通常为增加），质量标准中就需拟定有关物质检
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查项；而当均未有变化时，则可不拟定，因制剂质量标准仅关注降解/变化杂质，原料药中的
工艺杂质由于已在原料药质量标准中予以了控制，故制剂中就无需再要求[1,2]。某些进口制剂
或国外药典制剂质量标准中未拟定有关物质检查项便是出于以上考虑。
对于注射剂，经研究即便杂质无变化，但由于我国时常发生注射剂不良反应，故建议质
量标准中仍旧拟定，且指标可较原料药有所放宽。
二、杂质谱研究逻辑树
目前，全球药品研发皆提出了“杂质谱（impurity-profile  或 a list of degradation products）
研究”理念，即以原研药杂质谱为出发点进行仿制药的杂质研究，逻辑树如下：
原研制剂杂质谱 → 仿制原料药杂质谱 → 仿制制剂杂质谱
图1  杂质谱研究逻辑树
仿制制剂剂型与原研制剂剂型不同时，也可参照该思路[1]。
此处需强调的是：由于临床使用的是制剂，仿制制剂的降解杂质一般情况下与原研制剂
相同，而仿制原料药的开发往往是“殊途同归”，工艺杂质与原研原料药可能不一致，所以，
该研究逻辑树与原研原料药中的工艺杂质不一定无关，即无需对各国药典原料药质量标准项
下罗列的所有杂质逐一进行研究，仅关注其中与制剂相同的降解杂质即可，否则极易陷入“画
地为牢”的研发思维。
三、购买数批原研制剂
无论是仿制药研发还是品质评价，皆应获取至少3个不同时间段批号的原研制剂，并最
好有近效期的样品，以知晓该时间点时杂质的降解情况和含量。随后，取最新批号样品进行
加速或长期试验（至少6个月考察），进一步观测杂质降解情况和增长速率，同市场流通样品
做综合比较分析。
仿制药研发工作的启动，建议在原研品上市后即开始，一年购买1个批号，测定其多条
溶出曲线（如是口服固体制剂）和杂质谱，并观测近效期时这些指标的变化情况，以更科学
合理地指导届时自我仿制品的开发工作。
四、六类/五类仿制药研发思路
1. 解读既有质量标准
针对此类仿制药研发，建议查询所有可及的制剂与原料药质量标准；着重关注制剂质量
标准，解读试验条件、杂质种类、杂质质控限度等。至于原料药质量标准，应着重关注与制
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剂相同的主成分降解杂质。进口制剂质量标准中杂质往往用代号表示，研究者可根据以上杂
质谱研究思路，着重关注降解杂质，对于不增加/变化的杂质应理性考虑、酌情不予研究。
需强调的是：研发时仅是借用既有质量标准的检测色谱条件和目标降解杂质限度值（当
然也可根据具体情况，优化色谱参数和修订杂质限度），至于杂质种类和个数等是根据自我仿
制品的研发实际情况针对性地研究和拟定，绝非照搬照抄既有质量标准。国家药监局2006
年8月发布的《已有国家标准化学药品研究技术指导原则》中明确指出[3]：研发宗旨为“必要
时应针对研制品种的自身特点，拟定个性化的注册标准以更好地控制产品质量。不同生产单
位实现这一目标的药学基础可能不同，即可能会采用不同的原料药制备工艺、制剂的处方工
艺，这可能导致产品质量控制方法的不同。因此，在已有国家标准药品的研究中，不能机械
地套用已有的国家标准，需要遵循“仿品种而不是仿标准原则”，即在已有国家标准药品的研
制中，以研制产品与已上市产品安全性、有效性一致为目标，针对具体品种制定个性化注册
标准”。将该理念应用到有关物质研究，即不能过度“迷信”国外药典或进口质量标准，还是应
秉承科学客观的理念，以测得的原研制剂杂质谱为出发点。
2. 实践既有色谱条件并予以优化
2.1 色谱柱  建议采用25cm长普通色谱柱，以更有效增强分离效能，但也无必要用30cm长
色谱柱。不推荐使用“超高速液相”
[4]，除非普通液相确实难以达到分离效果，因该试验所
受干扰因素较多，难以重现，不便推广。
2.2 流动相  对于反相色谱检测，可适当减少有机相比例，使主成分保留时间延长、各峰分离
度增加，或至检出的杂质数不再增加[4]。
2.3 供试品溶液的主成分保留时间  推荐在15min~30min 间，由此全部检测时间约在
45~90min。如此，既可将各种杂质尽可能分离，又可通过调整峰宽与斜率，使保留时间
较长的杂质峰即便展宽也可积分出，不会导致漏检的情况发生。
2.4 流速与柱温  以满足上述保留时间为宜，流速无需拘泥于0.8~1.2ml/min间；柱温最好比
室温略高，如35～40℃，且该温度有利于延缓色谱柱使用寿命。
2.5 仪器配置  推荐具有自动进样装置的色谱仪，以便下班后仍可继续进行检测，提高工作效
率。
2.6 梯度洗脱时流动相配制方式  最科学方式为：“你中有我、我中有你（英国药典皆如
此）”—— 即A相为高比例水相-低比例有机相（建议时间起点时的流动相B最好为0%
比例）、B相为低比例水相-高比例有机相（建议其中至少为10%水相）；其次是A相为高
比例水相-低比例有机相、B相为纯有机相。最不科学的配制方式：A相为纯水相、B相
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为纯有机相，即便配制了脱气机，试验时也易造成气泡混入，导致柱压不稳、损伤仪器等
一系列问题，因此，如既有质量标准为此不合理方式，建议采用数学转换法更改为第1
或第2种配制方式。补充说明的是：水相中的无机盐、表面活性剂等的溶解方式最好采
用边加热、边搅拌方法，以期达到彻底溶解、不影响液相使用的目的。
2.7 梯度洗脱程序  皆可较为灵活地更改，如延长洗脱时间、调整最终两相比例、延缓每分钟
变化率等，已达到分离自我样品的目的。
2.8 目的采用最终优化的色谱条件，能够将仿制原料药/制剂的各工艺杂质/ 降解杂质/ 辅
料干扰等与主成分良好分离（最好还应检验原料药精制前的粗品，以下同）。此时的系统
适用性试验用溶液应将杂质:主成分配制成1:100浓度（或杂质界定限度）来验证专属性。
同时，还应进行强制降解试验[5]，用以验证各种强破坏试验条件下（高温、光照、高
湿、酸、碱、氧化等），主成分与产生杂质的分离检测结果，并应特别关注DAD检测条
件下主峰纯度，如不纯，则应适当调整色谱条件参数，将杂质分离出。此处需强调的是：
无需检测杂质峰纯度。
2.9 其他如认为既有质量标准拟定的供试品溶液浓度、波长、进样量等参数不甚科学，欲进
行更改，可参照文献[6]进行。同时，基于既有质量标准测定法的系统优化与改进过程应
在申报资料中予以呈现，并阐述理由，提供更新的实验条件及样品检测结果的对比分析等
说明材料，绝非仅陈述最终结果[7]。
3. 测定原研制剂杂质谱
3.1 检测时的注意事项
3.1.1 供试品溶液积分时最小峰面积的设定
在对供试品溶液积分时，其中一项重要参数就是最小峰面积的设定，即杂质报告限，ICH
在原料药与制剂中杂质研究指导原则中规定如下[8]：
表1 ICH对杂质研究的报告限要求
主成分每日最大摄入量  报告限(%)
＞2g  0.03%
原料药
≤2g 0.05%
＞1g  0.05%
制  剂
≤1g（通常小于1g）  0.10%
除非既有质量标准中有低于0.05%限度的杂质要求，通常可根据以上规定予以设定。如
仅进行仿制制剂研发，建议积分限度设定为0.10%；如要同时进行仿制原料药研发，遵循杂
质谱研究逻辑树，建议将积分限度设定为0.05%。这也同时考虑了方法学中最低检测限和最
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低定量限等指标的验证。之所以如此设定，盖因0.05%以下的杂质即便存在多个，对于人体
口服或注射，这些杂质的临床药理影响/毒副作用皆可忽略不计，故无需研究。
国家药品审评中心2008年组织翻译的《非专利药物杂质研究指导原则》[9]中明确指出：
“原料药生产商以及制剂开发团队进而对分析方法和质量标准进行协调，以避免出现对于生
产能力而言，质量标准限度过于严格等问题”。可目前很多研究者片面追求杂质数或杂质量，
将最小峰面积设定得很小（如0.01%），结果大量杂质被检出，进而开展起“无穷无尽的无用
研究……”，陷入了缘木求鱼的窘境。
3.1.2 杂质测定结果的记录保留值
小数点后两位即可，如0.25%、0.08%，不可多或少。
3.2 测定原研制剂杂质谱
采用以上色谱条件对原研制剂杂质谱进行测定。
如未能获得临近效期的样品，建议采用获得的最新批号样品进行影响因素试验，此举可
更快预知降解杂质的产生和影响产品稳定性的条件；同时，还应进行加速试验，试验时间视
效期而定（通常效期两年→加速6个月、三年→9个月、五年→12个月），以观测杂质变化
情况，尤关注不断增加的杂质。往往在加速试验3个月时，便可初现端倪。测定结果如图2
所示：
图2  原研制剂杂质谱测定结果
3.3 解读原研制剂杂质谱
3.3.1 杂质A和B  随时间延长、含量不断增加；加速试验也证明，结果分别为0.15%→0.50%
和0.20%→0.68%，故确定为主成分降解杂质。经核对原研制剂质量标准，通过相对保留时
间定位推算确定为某代号杂质；再根据既有质量标准，知晓该两杂质限度分别为0.7%和1.0%
（数字皆为举例、以下同）。
3.3.2 杂质C和D  随时间延长、含量不变化；加速试验也证明不增加，故推断为主成分原
料药工艺杂质或辅料峰。检测结果分别在0.33%~0.35%和0.07%~0.08%间波动。
4. 测定仿制原料药杂质谱
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美国FDA发布的《仿制制剂杂质研究指导原则》中明确指明[1]：ICH在新原料药与新制
剂中杂质研究指导原则中的许多建议完全适用于仿制药研究，故积分限度参照“3.1.1 最小峰
面积的设定”项下依据设定为0.05%。测定结果如图3：
图3  仿制原料药和仿制制剂杂质谱测定结果
4.1杂质A和B
研发要求：三批样品0天时的含量不应高于原研制剂起始点含量（即0.15和0.20%），
加速试验证实不断增加，但增加速度不快于原研制剂，且未超出限度值。
4.2杂质C
经研究确证为合成中间体、即合成工艺中引入的杂质。研发要求：三批样品0天时的含
量不大于原研制剂（如为0.31%~0.33%），加速试验证实不增加。
4.3 杂质D
未检出，说明该杂质为原研制剂特有杂质，勿需再研究。
4.4 杂质E和F
仿制原料药中特有杂质，三批样品0天时含量均分别为0.12%和0.07%。经验证，杂质
E为合成中间体杂质，因合成路径与原研原料药不同，加速试验证实不增加；杂质F增加、
为新增降解杂质，但至加速试验6个月时未超出0.2%。
表2 ICH对杂质研究的鉴定限要求[8]
主成分每日摄入量  鉴定限(%)
＞2g  0.05%
原料药
≤2g  0.1%或1mg
＞2g  0.10%
10mg ~ 2g  0.2%或2mg
1 ~ 10mg  0.5%或20μg
制  剂
＜1mg 1.0%或5μg
根据表2，由于以上两杂质均不过0.1%就无需鉴定；但考虑到最终临床使用的是制剂，
故可再根据制剂要求，放宽至0.2%（或是0.5%，以下同）。即仿制原料药中的特有杂质只要
最终含量未超过0.2%（主成分日剂量10mg ~ 2g），即可不进行结构确认等的进一步研究。
当特有杂质量超出0.2%，则建议对原料药合成工艺进行完善与优化，减少含量至鉴定阈
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值以下，否则就需进行结构确认→定量检测→甚至动物毒理试验推算该杂质限度值的深入研
究了[3]。此种作法虽说符合科学，但建议研发单位勿采取，这也是中心评审老师不愿看到的，
因为之所以要进行杂质谱比对研究，就是希望仿制制剂不具有超出鉴定限的特有杂质。总之，
该“技术瓶颈”是衡量药化人员水平的重要标志之一。
如研发制剂涉及的原料药为外购时，制剂生产企业可要求原料药企业按既定色谱条件进
行检测，若达不到要求，应进行精制优化，直至符合规定[9]。此时，往往会出现国内现行的
原料药质量标准达不到要求的现象。
5. 测定仿制制剂杂质谱
测定结果如图3所示。
5.1杂质A和B
研发要求：三批样品0天时的含量不应高于原研制剂起始点含量，加速试验证实不断增
加，但增加速率不快于原研制剂，且最终时间点含量未超出既有质量标准的限度值。
5.2杂质C
研发要求：结果同仿制原料药，加速试验证实不增加。
由于原研制剂在该杂质含量的前提下临床已使用了多年，验证了其安全性，且含量未超
过原研制剂，故仿制制剂与仿制原料药就可无需再深入研究该杂质[10,11]。只不过、为进一步
确认“保留时间相同、物质也一致”的论断，推荐采用液质联用色谱仪做一定性试验予以验证，
或者用两种以上色谱系统验证为同一物质即可。
有些研究者错误地以为不增加杂质也不能过鉴定限，导致对原料药过度精制纯化，造成
成本的无端增加[1]。
5.3 杂质D
未检出，同仿制原料药。
5.4 杂质E和F
研发要求：加速试验证实杂质E不增加。杂质F增加、但至加速试验6个月时未超出0.2%。
由于均未过鉴定限，故无需进行结构确认等进一步研究。
6. 质量标准的制订
6.1 杂质和辅料的定位
对于已知降解杂质A和B，通常采用对照品法或相对保留时间法，前者需制备对照品并
供日常检测用，后者简便易行，故推荐后者[1]。考虑到色谱柱的差异性，为确保试验的重现
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性，建议在研究时采用一根市场主流品牌、便于购买、价格合理的色谱柱，方法确证后在质
量标准中予以详尽标注，以便日后试验的重现[12]。如此，则无需担心多根不同型号色谱柱引
发的相对保留时间波动性。
检测制剂时有时会出现辅料峰，保留时间通常较短，可采用“扣除主成分峰相对保留时间
多少倍前的辅料峰”的办法；如辅料峰位于中间位置，则只能在质量标准中规定：取某辅料、
配制成某浓度进样测定，该辅料峰不计入的办法[13]。
关于质量标准中标注色谱柱型号事宜，很多研究者认为此举“方法耐受性不佳”，其实这
种认知是错误的。
6.2 杂质定量法
由于杂质与主成分结构式不同、紫外吸收不同，故在同一波长下采用峰面积代表含量时
需引入校正因子。针对杂质A和B的校正因子，如文献报道值已翔实确凿，则可直接采用；
如怀疑或不存在报道值，则需验证。方法如下：
采用液质联用仪或其他检测手段，甄别出该两杂质结构式，随后从国外药典会或某实验
室购买来（必须有纯度值），测得该杂质校正因子；或通过自我合成制备 → 结构式确认→ 获
得纯度值 → 测得校正因子。这里需提醒的是：无论何种途径获得的杂质对照品，纯度值无
需很高，只要该值准确、误差范围以内即可。针对特有杂质E和F，也是遵循以上方法获得
校正因子后计算含量。
通常，校正因子在0.9~1.1时可忽略，超出0.5~5.0时应考虑改变检测波长，如无法调
节，应考虑采用杂质对照品法[14]。
6.3 杂质限度的规定
杂质A和B由于是主成分降解杂质，故其限度值在既有质量标准应有规定，参照即可，
（如分别不得过0.7%和1.0%），其他杂质无需再参照既有质量标准，可自行拟定为：其他最
大单个未知杂质不得过0.5%（针对共有杂质C而言），其次单个未知杂质不得过0.2%（针
对剩余杂质，遵循ICH规定），所有杂质不得过1.5%（参照既有质量标准总杂质限度值）。
针对五类改剂型的研发，当用药途径一致时，仍可参照该限度制订；但如用药途径发生
改变，则应具体分析。
6.4 系统适用性试验
系统适用性试验除在方法开发时用到（通常是将多个杂质与主成分混合配制而成），在日
常检测中也应被使用，从而保证即时的色谱条件可满足测定需要。英国药典在所有液相法检
测有关物质时均有此项规定。通常可采用如下方法：
6.4.1 使用与主成分最难分离的某杂质  如方法开发时知晓原料药合成中间体G是最紧邻主
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成分峰前的杂质、则可将该杂质拟定入系统适用性试验中（规定分离度不得小于1.5），只要
保证了该杂质与主成分峰的分离，便可确保其他所有杂质的分离。由于仅验证分离度，故该
杂质纯度无需过高。该法也可采用最难分离的某两杂质峰予以验证[14]。
6.4.2 使用已知杂质对照品  如采用对照品法测定杂质A，则可规定该杂质峰与主成分峰具
有适当的分离度，以保证位于中间的杂质B与G能与主成分峰分开，而不能仅规定1.5的分
离度。
6.4.3 采用破坏试验  如主成分在某强破坏试验下较易产生杂质，且该杂质又在质量标准中
有所规定限制，则可采用，如图4所示：
图4  系统适用性强破坏试验图谱（下/空白溶剂；上/未破坏的供试品溶液；
中/氧化破坏试验：规定产生一主成分峰前的杂质峰，且分离度应符合规定）
6.4.4 不建议仅规定主成分峰柱效、拖尾因子等的简单作法，因为这些参数无法直接表达出
主成分与杂质的分离效果；至于“应使主成分峰与前后杂质峰分离”的规定更被是认为不痛不
痒、流于形式。
7. 复方制剂的研究
研究思路同前，仍是主要关注降解新增杂质，来源可能为：各原料间相互作用、原料与
辅料间相互作用、原辅料与包材间相互作用等。不同之处为：
7.1 色谱系统
研究阶段，通过确定色谱柱型号加以区域性分离、明确各杂质归属后进行检测的方法是
最为常用的[15,16]，且当一套色谱系统难以将各主成分与其所有杂质均分离时，完全可建立两
套/多套色谱系统进行测定。如色谱系统一测定主成分A及其杂质，色谱系统二测定主成分
B与其杂质，并验证在该各自系统条件下彼此互不干扰（可采用主成分原料药定位验证）。
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7.2 根据研究结果制订质量标准
如经以上研究，所有杂质均未增加/变化，则可在质量标准中不予制订有关物质检查项。
该思路对于氨基酸等大复方制剂更为适用。如仅主成分A的一个已知杂质不断增加，则质量
标准中仅制订该杂质测定法与限度，无需考虑其他杂质[17]。
目前，很多研究者为了体现自我对“杂质研究的深入和控制的强大”，将所有杂质均订入
了质量标准。这种作法是由于未能充分理解制剂质量标准仅关注降解杂质的理念！对于不变
化的杂质由于已在原料药/辅料中加以了制御，故制剂质量标准中便无需再控制。国外药典中
有些制剂品种的质量标准、有关物质检测项下杂质拟定得较为简单，就是出于此种考虑，绝
非是偷工减料、敷衍搪塞。
五、三类仿制药研发思路
研究思路同前，不同之处为：
1．色谱条件的建立
三类新药的质量标准属高度商业机密，通常无法获得，但可通过查询已发表的文献，寻
找到有关色谱条件的一些“蛛丝马迹”，如原研制剂药物代谢分析文献等，随后以此为基础进
行拓展。另外，还可参照相似结构化合物的既有质量标准分析方法，或者直接根据产品化学
结构式与理化性质等，建立起能够分离仿制原料药的起始物料、各步中间体、反应副产物及
降解产物等与主成分的色谱条件。同时，通过各种条件的强破坏试验验证所建立的色谱条件
的有效性与客观性。
2．原研制剂购买
必须购得才能进行研发，决不可“天马行空、盲人摸象”。如无法获得，建议研发“休眠”。
有时由于购买困难或价格昂贵，购买1批亦可；且往往难以购买到临近效期的样品。如可购
买到原研企业临床试验用样品用于自我仿制的早期研究也是可行的，待研发后期再够买原研
正式上市品做对比研究。
3．已知降解杂质限度值的设定
可通过以下方式获得[1]：
3.1 查询文献
如该降解产物是主成分的一个重要代谢产物，通常可通过查询文献获得。当然也可按
ICHQ3A（R）及ICHQ3B（R）进行杂质鉴定和界定，而对于制剂通用项目如脂肪乳中的甲
氧基苯胺、溶血磷脂可参考同类制剂一般限度标准制订。
3.2 测定近效期的原研制剂
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获得市场上流通的、临近效期的原研制剂样品，以测得数据为基础设定，这是最为科学
与通用的方法，但时常由于购买不到或无法获得该时间点样品，而采用对其进行长期稳定性
考察的替代法。
3.3 对原研制剂进行加速试验研究
根据原研制剂有效期，进行针对性的加速试验研究，以终时间点测得的数据为基础进行
设定。该法是3.2法的有效补充，但数据有时值得商榷。
3.4 采用软件计算
定量结构/活性相关软件程序(Quantitative structure / activity relationships，简称
QSAR）：这是一款通过建立于药物有机化合物活性与表征其结构特征的理化参数间的相关性
方程，测量或计算出该化合物的理化参数，从而估算出其对生物毒性的软件。但目前见诸于
报道应用的还十分少见，尚处于理论阶段。
3.5 进行杂质的动物毒理试验研究
通过该研究推算出限度值（此为不得已、最后选择的方法[11]）。实施时，应采用含有一定
量降解产物的制剂进行，或是采用分离制备的降解产物纯品进行。
以上方法研究者可酌情采用。同时，这些方法还适用于仿制品中出现特定、最终含量超
出鉴定限0.2%杂质的限度设定。针对未知不变化的杂质，根据“四、六类/五类仿制药研发思
路”项下思路制订。
六、强破坏试验
该实验于2001年由ICH 组织推出。其作用在世界卫生组织编撰的技术报告[18]和美国
FDA药品审评部门(CDER)发布的仿制药(ANDA)开发模板中均有明确阐述[19]：(1)探知主成分
易受何条件影响、从而指导处方开发与工艺设计，预防杂质生成（如易受热降解，则湿法制
粒应予排除，而采用干法制粒）；(2)探知主成分降解途径，旨在验证所建立色谱条件的系统
适用性，尤三类仿制药研发中的应用。进行该试验的思路如下：
1．对于稳定的强破坏试验条件
如药物在某强破坏试验条件下较为稳定，即便加大破坏强度也无法产生杂质时，此时实
事求是阐述即可，无需过于强求[20]。但同时要采用DAD检测器验证主成分峰纯度，确保主
峰中不包含杂质峰。客观而言，对于一个有机合成药物，是很少在所有条件下均稳定的[21]。
2．对于不稳定的强破坏试验条件
建议以主成分峰面积减少5~10%、杂质量产生5~10%为最佳破坏条件（这也是迄今为
止破坏方法与破坏强度不做硬性规定的原因）[21]；同时采用DAD检测器验证主成分峰纯度。
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现今，有些研究者陷入了“剧烈破坏 → 产生某较大杂质 → 确证结构式 → 获得杂质对
照品 → 进行动物毒理研究 → （结论往往是该杂质无毒理作用、限度可很宽泛；检测最终
样品，结果是“未检出”）……”这种“走火入魔”的研究思路，应予静心思量。
3．强破坏试验条件的“质量守恒/ 物料平衡”
近些年，该观点在业内可谓甚嚣尘上，如何判定也是众说纷纭。笔者查询了截至2013
年7月底，药审中心颁布的所有指导原则、电子刊物和《药品审评论坛杂志》，仅1~2篇涉
及此观点。持这种思考的个别学者，猜测是与“稳定性考核”中含量与有关物质的相辅相成性
混淆了。同时，如此剧烈的破坏。有时还会产生二级、甚至三级降解产物，如非要守恒，也
许只能采用“全波长、全梯度”的洗脱方式，且所有杂质还都要有紫外吸收，但这是完全不现
实、脱离实际的。所以笔者认为：若“守恒”意为着破坏前后总峰面积比在90%~110%，则只
要“温柔破坏”、使其产生5~10%杂质量，则便“肯定守恒”了，呵呵~~。
4．制剂辅料的强破坏试验条件
辅料的强破坏试验其实为“主成分与辅料的相容性试验”，用以判断两者间的兼容性，从
而为处方筛选、制剂工艺优化等提供科学依据（如某辅料不稳定，应摒弃或最后着附），故应
属工艺研究部分，不应在有关物质测定法的方法学验证中出现。
5．强破坏试验的结论
据笔者自身试验与交流所得，只要保证主成分保留时间在15min后，则几乎没有推翻既
有色谱条件，最终均是“本色谱条件可分离出各种强破坏试验产生的杂质，故色谱条件系统适
用性良好”的“形式化结论”。
总之，我们应清醒客观地看待该实验，科学正确地理解实验目的，不要将其“神圣化与妖
魔化”。
七、稳定性考核中含量与有关物质的相辅相成性
在进行稳定性考核时，通常需进行“影响因素试验”、“加速试验”和“长期试验”及“中间试
验”，其目的是模拟药物在市场流通期间有可能遭遇到的较为苛刻环境时，其内在品质的稳定
性与持续性。此时，含量结果与有关物质结果间应具有“呼应性”，以此来说明所建立的有关
物质色谱条件的科学性和客观性。
该呼应性应在以上三项试验中有所体现，尤在后两项试验中体现得更为明显，如加速试
验6个月较0个月时含量下降5.0%，则有关物质增加量应在4.5~5.5%间，否则说明所建立
的有关物质测定法未能准确测得降解杂质量，属“研发中的原则性错误”。反之，亦然。所以
研发者应着重关注该点。
上海市食品药品检验所谢沐风撰写
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同时，也不应出现前一时间点杂质量明显大于后一时间点的情形。
八、杂质谱研究的总结归纳
杂质谱研究不仅要体现在图谱上，还应采用列表方式予以表述，以做到条理清晰，使评
审老师一目了然，并将列表结果置于稳定性考核资料中。列举如下：
表3  原研制剂杂质谱研究结果一览表
样  品  杂质A  杂质B  杂质C  杂质D  杂质E  杂质F
批号-1  0.15% 0.20% 0.34% 0.08%  未检出  未检出
批号-2  0.14% 0.19% 0.35% 0.07%  未检出  未检出
批号-3  0.15% 0.21% 0.33% 0.07%  未检出  未检出
批号-1（加速试验1个月）  0.26% 0.34% 0.35% 0.08%  未检出  未检出
批号-1（加速试验3个月）  0.37% 0.48% 0.33% 0.07%  未检出  未检出
批号-1（加速试验6个月）  0.50% 0.68% 0.34% 0.08%  未检出  未检出
表4  仿制原料药杂质谱研究结果一览表
样  品  杂质A  杂质B  杂质C  杂质D  杂质E  杂质F
批号-1 0.13% 0.18% 0.31%  未检出  0.12% 0.07%
批号-2 0.15% 0.19% 0.33%  未检出  0.11% 0.08%  0个月
批号-3 0.14% 0.20% 0.32%  未检出  0.12% 0.08%
批号-1 0.25% 0.32% 0.33%  未检出  0.12% 0.10%
批号-2 0.26% 0.32% 0.33%  未检出  0.12% 0.11%  加速试验1个月
批号-3 0.25% 0.31% 0.34%  未检出  0.11% 0.12%
批号-1 0.38% 0.47% 0.33%  未检出  0.13% 0.14%
批号-2 0.37% 0.46% 0.31%  未检出  0.11% 0.14%  加速试验3个月
批号-3 0.38% 0.47% 0.33%  未检出  0.12% 0.15%
批号-1 0.48% 0.63% 0.32%  未检出  0.11% 0.16%
批号-2 0.49% 0.63% 0.32%  未检出  0.11% 0.17%  加速试验6个月
批号-3 0.48% 0.65% 0.31%  未检出  0.12% 0.17%
表5  仿制制剂杂质谱研究结果一览表
样  品  杂质A 杂质B 杂质C 杂质D 杂质E  杂质F
批号-1  0.14% 0.19% 0.32% 未检出 0.11% 0.12%
批号-2  0.15% 0.20% 0.31% 未检出 0.12% 0.13%  0个月
批号-3  0.13% 0.20% 0.33% 未检出 0.10% 0.11%
批号-1  0.24% 0.32% 0.33% 未检出 0.10% 0.13%
批号-2  0.24% 0.33% 0.34% 未检出 0.11% 0.14%  加速试验1个月
批号-3  0.24% 0.32% 0.33% 未检出 0.10% 0.13%
加速试验3个月  批号-1  0.36% 0.48% 0.33% 未检出 0.11% 0.15%
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批号-2  0.38% 0.48% 0.33% 未检出 0.11% 0.15%
批号-3  0.36% 0.49% 0.32% 未检出 0.12% 0.14%
批号-1  0.49% 0.66% 0.32% 未检出 0.11% 0.18%
批号-2  0.48% 0.67% 0.32% 未检出 0.11% 0.17%  加速试验6个月
批号-3  0.49% 0.66% 0.33% 未检出 0.12% 0.18%
表6  各杂质研究结论一览表
杂质  来  源  仿制品研究结论
A  降解杂质  增加、且增速同原研制剂
B  降解杂质  同杂质A
C  工艺杂质  不增加、含量未超出原研制剂、无需研究
D  工艺杂质  原研制剂特有，仿制品中均无，无需研究
E  工艺杂质  原研制剂无，仿制品特有。研究结果不增加，且未超出鉴定性（0.2%），故无需研究
F  降解杂质
原研制剂无，仿制品特有。研究结果增加，但加速试验6个月和长期试验24个月
（已至效期）均未超出鉴定性（0.2%），故无需研究
（注：杂质量在0.03%间波动，则认为无变化）
以上仿制制剂批间数据如出现较大波动，则说明制剂工艺不稳定（此时，多条溶出曲线
研究也往往出现批间波动较大的情形），认为研发失败，应重新进行
[1]。为确保合成工艺稳定、
原料药质量均一，就要确保原料药的杂质谱稳定；而为达到该要求，则应针对性地研究仿制
品中特有杂质的来源（如杂质E），从而引申至对起始物料和关键中间体的质量控制。
九、试验技巧与注意事项
1．归一化法的妙用
ICH 组织自2000年在有关物质检测中推出了自身对照法，旨在针对那些稀释50~200
倍后，主成分峰面积不呈线性的药物而言，因此时归一化测定结果有误。但此种情形在实际
检测中并不常见，仅为“小概率事件”。
笔者总结出主要有以下几种情形不呈线性：(1)主成分为满足杂质检出限要求，在进样量
过大的情况下发生色谱柱或检测器超载；(2)主成分结构式较为怪异，如唑来膦酸，磷原子与
氧原子间形成双键结构（结构式见图6），导致线性范围很窄；(3)梯度洗脱，此情形下色谱峰
已呈非正常性能，柱效高达上万也是此种表现。(4) 供试品溶液浓度过低，导致1.0%自身对
照已接近最小定量限。
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图5  唑来膦酸结构式
所以，建议研究者验证两法，如结果一致（绝对值差不超过0.03%），可在质量标准中拟
定自身对照法，而对研发中的大量样品检测均采用归一化法[14]，从而做到活学活用、起到事
半功倍之效能。目前，印度等一些制药公司在研发与制订质量标准时仍是均采用归一化法，
便如此。
2．针对申报资料中所附的有关物质研究图谱要求
2.1 整齐划一  所附图谱均应采用同种色谱仪，即色谱图模板一致；且所有图谱的X轴与Y
轴均应一致，以便评审老师进行直观的杂质谱比对与结果核查。Y轴的设定以1%自身对照液
中主成分峰峰高约10%~20%为宜。
2.2 图谱标识与摆放  每张图谱的标识建议采用打印机在图谱空白处打印出来（如“仿制制剂
批号2样品加速试验3个月有关物质测定”），字号至少3号，再进行加深复印，随后按试验
时间顺序摆放。不建议：建立一大列表、置前，图谱上仅标注图谱号，如此查找起来极为繁
琐，且不直观。
2.3 图谱基线的稳定性  无论何种洗脱方式，均应确保空白溶剂基线平稳后再行检测（以上
述Y轴设定的范围为准）。如无法满足，应从仪器硬件性能与操作等环节入手加以解决。该
点充分展现分析人员液相操作的基本功。
2.4 申报材料中应附图谱  有关物质研究的代表性图谱均应附上，尤方法探索过程、方法学
验证、典型样品测定、稳定性考核等图谱；至于非有关物质图谱，由于仅关注主成分峰，故
象征性地附几张典型图谱应可。
2.5 积分参数的统一性  各稳定性考核时间点的积分参数均应一致，以便系统性地观察杂质
变化情况。
3．溶液稳定性
供试品溶液稳定性的验证至关重要，验证法详见参考文献[22]。一般情况下应至少考察
24小时，以保证当日配制的样品在当晚自动进样情况下测定完毕。如不稳定，应制订“立即
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进样”或“配制后X小时内进样测定”的明确规定，以保证试验的顺利进行。
主成分对照品溶液、杂质对照品溶液及贮备液的稳定性，可根据稳定性试验结果适当延
长，如冰箱冷藏3～6月。
4．杂质校正因子测定法
关于杂质校正因子测定法，文献报道有单点法、三点法、多点法及标准曲线法等多种。
其实，采用最为简便易行的单点测定法即可：取杂质对照品与主成分对照品均配制1.0%浓度，
连续进样6次，测得平均峰面积，计算校正因子；如此测得结果也必在误差范围内。
5. 研究测定与制订质量标准时测定法的变更
研发时为分离杂质有可能采用较为复杂的色谱条件（如梯度洗脱）或系统（如两套液相
系统或液相、薄层2个方法），但制定质量标准时，应根据研究测定结果（杂质增加改变与否），
酌情采用较为简化的测定条件去针对性仅测定相关杂质，而非全盘照搬照抄研究时的方法。
十、讨论
1. 效期的确定
原研制剂的效期往往通过观测货架期间，降解杂质A和B临近限度值时的时间而定。仿
制药研发时，可能会出现杂质降解速度快于原研制剂的情形，从客观和合理的角度，可通过
缩短效期来保证仿制制剂在临床使用时的安全性。
但现今，随着对药品质量的日益关注，效期长短愈发作为评价品质的一个核心指标受到
重视。由于仿制药研发在全球的迅猛开展，各国纷纷提高了“技术门槛”：仿制制剂的效期应
等同或大于原研制剂。由此，研发时应做到：仿制制剂中与原研制剂相同的降解杂质A和B，
在0个月测得值和加速试验中的增加速率均不应超过原研制剂，且应通过“降解速度曲线外推
法”来预测效期[23]，如此才可满足内在品质不劣于原研制剂的要求[3,19]；如超出，应考虑优化
处方工艺或采用密封性更好的包装[9]、或是其他办法予以解决。
2. 杂质研究的“度”
现今业内普遍存在杂质研究过度的状况，以为研究得越深、质量标准制订的杂质数量越
多（杂质罗列甚至已排满26个英文字母；手性异构体杂质高达10多种等）、要求越高越好。
其实，这种认知是片面的。
2013年5月，国家药典委员会网站发布了“国家药品标准工作研讨会议纪要[24]
”，其中明
上海市食品药品检验所谢沐风撰写
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确提出：药品质量标准的关键在于临床，标准的提高不是一味追求某个单一杂质控制；过去
我们忽略了临床药学评价，今后要加强质量标准的提高与临床用药的有机结合。标准的制/修
订还应考虑社会和经济因素，应科学合理、不宜过度追求高指标，科学的标准不一定都是高
精尖的，还应当从药物经济学角度予以客观考虑……。
正如文中3.1.1所述，当我们科学客观地引入“ICH报告限”概念后，便可将杂质研究的“度”
清晰化、明朗化。该理念在英国药典贯彻得最为彻底：在所有采用液相法检测有关物质时，
均做出了“Disregard（不计）……”规定：小于1.0%自身对照峰面积1/10~1/20的杂质峰不计，
即0.1%~0.05%含量以下的杂质峰勿需积分，因为这些微量杂质即便存在了多个，对人体的
临床毒理作用也完全可忽略不计。只不过，我国药典2010年版中仅有25个品种有此规定，
其他几百个液相法检测有关物质均未意识到该点，导致实验者忽略了该报告限的关键要素。
又如杂质C，只要仿制药含量不过原研制剂，即便超过鉴定限0.2%，也无需再研究。再
如杂质F，此处列举了较为极端情形：为新增降解杂质，但在效期内含量未过鉴定限0.2%，
故无需开展针对性研究，最终质量标准中笼统限定即可。
因此，研发者一定要把握好杂质研究的“度”，切忌陷入“疑神疑鬼、谨小慎微的误区”中。
3. 客观分析杂质量多寡、品质评价和临床疗效三者间的关系
现今业内普遍存在“杂质越少、药品质量越佳”的看法。笔者认为：这种理念仅片面关注
了杂质量，没有与临床疗效客观结合，故是局限的。如杂质B限度1.0%，就不应认为0.2%
含量的样品品质高于0.8%含量的样品品质，因只要在1.0%以下，杂质量的多寡就与临床安
全性和对主成分的影响性无关、无需担忧。否则，一旦陷入“好大喜功”的思维模式，就会导
致原料药和制剂的生产成本无端增加，而该增加对临床疗效又无丝毫意义，造成“华而不实、
大而无当”的结果。故对杂质评价一定要站在一个科学客观的立场上。
4. 从宏观上看待杂质研究的重要性。
制药行业为高科技行业、高端制造行业、高附加值行业，这“三高”决定了本行业在发达国
家被严格掌控和保密。而在各国药典上，原料药项下的杂质信息可谓毫无保留、全部陈列，
同时还可花钱购买，由此可见，杂质研究就不应是高科技！因真正的高科技是绝对不可能全
球公开的。
那本行业的高科技在何处？在制剂上 → 在配方与工艺 → 在工业药剂学的各项参数上
[19]，而这些绝对是高度的商业机密。跨越这道门槛的办法就是“殊途同归”：原料药与制剂皆
如此。所以笔者再次强调：既有进口/国外药典质量标准中那些杂质列表，并不完全适用于我
们自行的仿制药研发（仅有降解杂质是共性的），众人决不能墨守成规、生搬硬套，还是应理
性研发、科学审评，将重点关注于药物的临床有效性上。
上海市食品药品检验所谢沐风撰写
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笔者在日本国家药检所进修期间，深刻体会到ICH组织国家们在药物有效性上的严格要
求与深入研究，如针对口服固体制剂而言体外溶出最为关键，该指标与临床疗效最为密切相
关；且因口服，安全性大大增强，故杂质研究仅是“锦上添花”。所以，该国对上市药品进行
质量评价与上市抽查时皆是仅测定多条溶出曲线，以考核企业是否具有持续生产高品质药品
的能力[25]。
5. 注射剂的不良反应是“杂质所为”吗？
由于静脉注射剂不存在主成分生物利用度问题，故很多学者“一边倒地”将注意力聚焦到杂
质上，更是认为注射剂的不良反应是“杂质所为”。此处笔者“斗胆”提出：注射剂的不良反应，
在排除质量因素后（即与原研制剂杂质谱相当以及其他质量指标没问题的前提下），绝大部分
是主成分“缺点”所致，而非那些微量杂质所为。
简述如下：世界卫生组织很早就指出“能吃药不打针，能打针不输液”的用药原则，因“是
药三分毒”，药物（主要指主成分）是把“双刃剑”，即有七分优点、三分缺点，口服时通过消
化道屏障，则可实现“取其精华、去其糟粕”之功效；且生物利用度也说明一个药物在人体内
的吸收速度与程度十分关键（有些需要慢吸收的药物就一定要慢，绝非越快越好，否则会引
起毒副作用）。而静脉注射时，由于无任何人体屏障，主成分的优缺点（当然还有少量辅料、
也夹带着微量杂质、不溶性微粒等）被人体“一股脑儿”地全部吸收，此时就会出现因人体机
能的千变万化、林林总总，导致主成分缺点大于优点的“小概率事件”必然发生！这是完全符
合科学的、是客观存在的事实[26,27]。所以，为使该发生率控制在合理范围，在发达国家严格
控制静脉滴注的临床使用，而我国由于注射剂临床使用量较大，导致该小概率事件被增加、
不良反应偏高。具体论述请详见参考文献[28]。此时，如我们将大量学术研究集中于该点、
就是剑走偏锋、甚至误入歧途。
很希望通过此文，与阅读者展开研讨，共为祖国制药行业呈上一份绵薄之力。
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上海市食品药品检验所谢沐风撰写
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