方法开发缓冲盐选择指导原则

前言
! a8 W4 K! Q: h7 t3 g液相方法很多用到缓冲盐，我在从事研发工作的过程中，发现很多同仁对缓冲盐在液相方法中的应用不是太了解，遂分享一部分我的看法，抛砖引玉，相互交流。

) k# C( \7 n, R+ s适用范围
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7 V* j5 v7 P8 H; V- Q本指导原则仅适用于反向色谱与离子对色谱方法开发过程。
何时应用缓冲盐？
! W& k8 Z; [, }$ y0 W
/ J; l' v0 k, A$ k% H  s样品或样品中需研究的关键杂质有离子化倾向，其他特定少数情况另行叙述。
5 i$ V9 _) X& `, g存在较强离子化倾向的组分，其中一部分是分子状态，与反相色谱固定相结合的更好；另一部分是离子状态，更亲和于流动相。如不使用缓冲盐控制其电离状态，即分子状态和离子状态的比例，很容易出现峰拖尾分叉变形的情况。这种情况下一般就不应该使用水/有机相系统作为流动相，应选用缓冲盐/有机相系统。
缓冲能力与pH选择

* ?7 k2 B' M9 K& A9 w流动相如用到缓冲盐溶液，其应当有一定的缓冲能力，如果减少进样量，峰形改善，则说明很可能缓冲盐溶液缓冲能力不足。缓冲盐溶液的缓冲能力与缓冲盐浓度、缓冲盐溶液的pH值相关。缓冲盐浓度越大，缓冲能力越强；缓冲盐溶液的pH值越接近其pka，缓冲能力越强。一般缓冲盐溶液的pH值应在其pka±1的范围内，为了确保主成分的保留时间不因pH值的微小变化产生大的偏离，缓冲盐溶液的pH值应在样品pka±2的范围外。

1 e- @9 R8 M7 J# S) ?截止波长
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每种缓冲盐都有其对应的截止波长，方法的检测波长不得小于缓冲盐溶液的截止波长。检测波长越接近流动相截止波长，基线噪音越大，响应值误差越大，组分响应值和灵敏度变小。
0 M5 }  ]; |' y$ y& I+ B* _常用缓冲盐pka与截止波长列表

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缓冲盐	pka	缓冲范围	截止波长
磷酸盐	2.1	＜3.1	＜200nm(0.1%)
	7.2	6.2-8.2
	12.3	11.3-13.3
甲酸盐	3.8	2.8-3.8	210nm（10mM）
乙酸盐	4.8	3.8-5.8	210nm（10mM）
碳酸盐	6.4	5.4-7.4	＜200（10mM）
三乙胺	11.0	10.0-12.0	＜200（10mM）
三氟乙酸	≥2	1.5-2.5	210nm(0.1%)

+ g6 Y$ O( k$ K: Y$ ?/ ~+ \缓冲盐应用一般思路
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1、 缓冲盐浓度一般为10-50mmol/l。根据样品性质及进样量选择缓冲盐浓度，使其满足应有的缓冲能力。

# _! ^- T. T) Q9 e# f/ @' u2、 梯度洗脱中有机相比例允许的最高值，应根据缓冲盐与有机相混溶实验确定。取不同缓冲盐-有机相比例，确定有机相比例允许最高值，如缓冲盐：有机相为10:90、20:80、30：70等不同比例。不得在仪器上随意设置高比例有机相，以防缓冲盐析出损坏仪器。

3、 根据截止波长、pH值和缓冲能力等多个约束条件选择缓冲盐，如检测波长在末端吸收，则一般应选用磷酸盐。

: |$ E, j8 n4 {& V4、 常用缓冲盐溶液有：0.1%磷酸/三氟乙酸/乙酸/甲酸溶液，0.02-0.05mol/l 磷酸二氢钾溶液（用磷酸调节pH至3.0）等
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) X+ E1 L+ g4 ^ 5、碱性化合物优选钾盐，抑制拖尾效果更好。

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   作者：占小兵 上海博志研新药物技术有限公司
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