厚朴配方颗粒药渣中厚朴酚及和厚朴酚的提取纯化研究

厚朴配方颗粒药渣中厚朴酚及和厚朴酚的提取纯化研究

**1,2,3史新元1张志强2,3董晨虹2,3
1. 北京中医药大学中药学院2. 北京康仁堂药业有限公司  3. 中药配方颗粒关键技术国家地方联合工程研究中心  




摘 要
目的对经过水提取的厚朴配方颗粒药渣中厚朴酚及和厚朴酚进行提取、纯化研究。方法本文对厚朴配方颗粒生产后的药渣进行研究,借助大孔树脂分离纯化技术对药渣中的脂溶性成分厚朴酚及和厚朴酚进行提取、纯化工艺的研究,实现中药资源的再次利用。结果粗提物出膏率约为4.56%,其中和厚朴酚含量约为19.94%,厚朴酚含量约为35.83%,两种酚的总含量约为55.77%。结论目前,全国厚朴配方颗粒年投料量约150吨,按《中国药典》厚朴项下2.0%的含量标准,可从废弃的药渣中提取厚朴酚及和厚朴酚3000公斤,按照50%纯度的市场售价约1000元/kg,从废弃的厚朴药渣中,废物再利用可产生300万的效益。


近年来，随着国内外依赖中药和天然药物资源为原料的大健康产业迅猛发展，药渣产生量剧增，但由于提取工艺、设备和管理因素的制约，药渣等废弃物未能得到有效利用，不仅造成资源浪费，且导致生态环境的严重污染[1,2]。杨晓辉[3]对甘草废渣中的成分进行了鉴定。刘常青等[4]比较了丹参药材与丹参药渣中丹参酮ⅡA的含量，周萍等[5]测定了黄芪药渣中黄芪甲苷的含量，结果均说明中药药渣仍有较大的再利用价值。中药配方颗粒法定的提取溶媒为水溶液，其药渣中还残存有大量的脂溶性成分，资源的浪费问题更为突出。
厚朴是中国常用中药，厚朴酚、和厚朴酚是厚朴的两种主要活性成分[6,7]。厚朴酚衍生物对结肠癌细胞有抑制作用，和厚朴酚对过氧化氢诱导的人神经母细胞瘤细胞损伤具有保护作用[8,9]，它们在新药开发、临床应用环节有极大的潜力。但是，厚朴酚及和厚朴酚均为脂溶性成分，在配方颗粒生产过程中大多残留于药渣中，尚未得到有效利用。
本文以厚朴为研究对象，对其药渣进行提取、纯化工艺的研究，为中药渣的再利用提供借鉴。
1 仪器与试药
1.1 仪器


岛津LC-20A高效液相色谱仪(日本岛津株式会社);Labsolution DB工作站;十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱(艾杰尔);ME104E电子天平(梅特勒·托利多仪器(上海)有限公司);98-1-B电热套(天津市泰斯特仪器有限公司);XP-26电子天平[梅特勒·托利多仪器(上海)有限公司]。

1.2 试剂及试药


厚朴药材及药渣由北京康仁堂药业有限公司提供，从生产现场随机抽取三批，标记为厚朴药渣-01、厚朴药渣-02、厚朴药渣-03，对应的三批药材标记为厚朴药材-01、厚朴药材-02、厚朴药材-03。

厚朴酚对照品(110729-201915，中国食品药品检定研究院)、和厚朴酚对照品(110730-201915，中国食品药品检定研究院);乙醇(分析纯)、甲醇(分析纯、色谱纯)、蒸馏水。



2 方法和结果
2.1 药渣中厚朴酚及和厚朴酚含量测定
2.1.1 对照品溶液及供试品溶液的制备方法


(1)对照品溶液的制备:取厚朴酚对照品、和厚朴酚对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度分别为厚朴酚40μg/m L、和厚朴酚24μg/m L的溶液，即得;(2)供试品溶液制备:参照《中华人民共和国药典(一部》，取厚朴药渣，粉碎、过三号筛，取约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 m L，摇匀，密塞，浸渍24小时，滤过，精密量取续滤液5 m L，置25 m L量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.1.2 色谱条件


参照《中华人民共和国药典(一部》，色谱柱:C18柱(规格4.6×250 mm,5μm);流动相:甲醇:水(78:22);检测波长为294 nm，流速为1.0 m L/min，柱温25℃，进样量4μL，理论板数按厚朴酚峰计算应不低于3800。

2.1.3 系统适用性


分别吸取供试品及对照品溶液，按照2.1.2项下色谱条件进行测定。结果显示，供试品溶液色谱峰中，与厚朴酚及和厚朴酚对照品溶液色谱峰相同位置出峰，理论板数以厚朴酚峰计算不低于3800，且分离度较好，无拖尾，无干扰。

2.1.4 方法学考察


(1)线性关系考察:取厚朴酚对照品适量，加甲醇制成浓度为150μg/m L的溶液，作为厚朴酚对照品母液;分别精密吸取厚朴酚对照品母液1 m L、3 m L、5 m L、10 m L、15 m L、20 m L、25 m L，置于25 m L容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过;取和厚朴酚对照品适量，加甲醇制成浓度为100μg/m L的溶液，作为和厚朴酚对照品母液;分别精密吸取和厚朴酚对照品母液1 m L、3 m L、5 m L、10 m L、15 m L、20 m L、25 m L，置于25 m L容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过;精密吸取上述续滤液5%L，注入超高效液相色谱仪，按2.1.2项下色谱条件分别测定厚朴酚峰面积、和厚朴酚峰面积，以峰面积为纵坐标，对照品的浓度为横坐标，观察是否呈线性，再用最小二乘法进行线性回归，求得厚朴酚回归方程为y=5300.3x+169.42,R=0.9999，和厚朴酚回归方程为y=5306.4x-101.65,R=0.9999，线性关系良好。(2)精密度试验:精密称取厚朴药渣，按2.1.1项下方法制备供试品溶液，按2.1.2项下的色谱条件，连续测定6次，分别计算厚朴酚、和厚朴酚色谱峰面积，结果显示RSD分别为0.45%、0.12%，表明系统精密度良好。(3)重复性试验:精密称取同一批次厚朴药渣6份，按2.1.1项下方法制备供试品溶液，按2.1.2项下色谱条件进行测定，分别计算厚朴酚、和厚朴酚色谱峰面积，结果显示峰面积RSD分别为2.15%、1.12%，表明方法重复性良好。(4)稳定性试验:取重复性试验项下的一供试品溶液，按2.1.2项下色谱条件分别在0小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时进行测定，计算厚朴酚、和厚朴酚色谱峰面积，结果显示RSD分别为0.65%、0.22%，表明供试品溶液在24小时内稳定性良好。(5)加样回收试验:精密称取6份已知含量的同一批次样品，按2.1.1项下方法制备供试品溶液，同时加入对照品溶液，平行制成6份供试品溶液。按2.1.2项下色谱条件测定回收率及RSD。结果显示厚朴酚为102.1%、和厚朴酚为97.7%。

2.1.5 厚朴药渣样品含量测定


对厚朴药渣中残留的成分含量进行测定，具体见表1。结果可知，水煎煮提取后的厚朴中厚朴酚与和厚朴酚还有大量残余，随机抽取的三批药渣中，两者的残留率在70%以上，且总含量均值为3.34%，高于药典中厚朴药材厚朴酚及和厚朴酚总量不得少于2.0%的标准限度。将厚朴药渣作为废弃物直接处理将对中药资源造成极大浪费。为此，下文将厚朴药渣作为原料，进行厚朴酚及和厚朴酚提取纯化工艺研究。

表1 厚朴药渣中厚朴酚、和厚朴酚含量测定结果
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2.2 厚朴酚及和厚朴酚的提取工艺考察
2.2.1 提取方式优选


以提出的厚朴酚及和厚朴酚总量为指标，考察超声法和回流法的提取效果。取厚朴药渣粉末(过一号筛)共6份，每份约10 g，分别加入80%乙醇200 m L进行超声和加热回流提取，提取时间为30分钟、60分钟、90分钟，过滤，滤液减压浓缩后，50℃真空干燥12小时，称重，计算出膏率。取少量粉末，按照2.1下方法制备供试品溶液并进行含量测定(具体见表2)。结果可知，以提取总量为评价指标，回流显著优于超声，故选择回流法作为提取方法。

表2 厚朴提取方法比较结果
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2.2.2 提取溶剂及次数优选


以厚朴酚及和厚朴酚总含量为评价指标，优选提取溶剂与提取次数。取厚朴药渣4份，每份约10 g，以60%、80%乙醇分别回流提取1次、2次，每次加200 m L溶剂，回流30分钟，合并提取液至500 m L容量瓶中，加相应溶剂定容到刻度，取10 m L于蒸发皿中，水浴蒸干，用甲醇溶解，定容到50 m L，过滤，得供试品溶液，按2.1.2项下的色谱条件进行含量测定(具体见表3)。结果可知，用60%乙醇提取优于80%乙醇，提取2次优于1次，故确定提取溶剂为60%乙醇，提取次数为2次。

表3 厚朴提取溶剂及提取次数考察结果
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2.2.3 提取溶剂量优选

以厚朴酚以及和厚朴酚总含量为评价指标，优选提取溶剂量。溶剂倍量设定为10倍、15倍及20倍，其他过程同2.2.2(具体见表4)。结果可知，在本文所设条件范围内，随着溶剂量增加，两种酚的总含量呈增长趋势，20倍为最优。但溶剂倍量增加带来的含量增加幅度并不大，考虑到提取溶剂成本，本文选定10倍量溶剂进行提取时间考察，以期在较低的溶剂倍量下获得较好的提取效果。

表4 厚朴提取溶剂量考察结果
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2.2.4 提取时间优选


以厚朴酚以及和厚朴酚含量的总量为评价指标，优选提取时间。两次提取时间分别为30分钟、30分钟;60分钟、30分钟;90分钟、30分钟;90分钟、60分钟，其他过程同前(具体见表5)。结果可知，用10倍量60%乙醇回流提取，随着提取时间延长，提取液中厚朴酚、和厚朴酚及两者总含量均逐渐增加，两次提取时间为90分钟、60分钟时总含量为3.42%，提取已近乎完全，故确定提取时间分别为90分钟、60分钟。

表5 10倍溶剂量的提取时间考察结果
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通过上述实验，确定最佳提取工艺为:10倍量60%乙醇回流提取2次，时间分别为90分钟、60分钟。
2.3 厚朴酚及和厚朴酚的分离纯化
2.3.1 大孔树脂型号筛选

采用静态法，以树脂的比吸附量和解析率为综合评价指标，对AB-8及D101两种树脂进行优选。(1)厚朴样品液的制备:取100 g厚朴药渣，按照2.2项下最佳提取工艺提取、过滤，减压回收至无醇味，作为厚朴样品液。(2)大孔树脂的活化:采用乙醇湿法装柱，在提取器中加入高于树脂层10～20 cm的乙醇浸泡12小时，过滤，树脂用乙醇反复洗至流出液加3倍量水不显浑浊为止，再用大量蒸馏水洗至流出液无醇味备用。
吸附:称取活化后的树脂各20 g (湿重)，置250 m L锥形瓶中，分别加入50 m L厚朴样品液，密塞，室温振摇18小时，充分吸附后，抽滤，分别测定吸附前后的药液中两种目标物质的总量之和，计算比吸附量。比吸附量=(C0-Ce)×V/W(注:比吸附量mg/g;W:干树脂重;V:溶液体积;C0:原样品液浓度;Ce:吸附后溶液浓度)。
解析:吸附后的树脂加入60%乙醇120 m L，恒温振摇24小时，充分解析后，抽滤，测定滤液中两种酚的总量，计算解析率(%)。解析率(%)=解析量/吸附量×100%。
表6为两种树脂对厚朴酚、和厚朴酚的吸附及解析情况考察结果。由表可知，AB-8与D101两种大孔树脂对两种成分的比吸附量基本相同，但AB-8的解析率略优于D101，故选择AB-8型大孔树脂。
2.3.2 吸附条件考察

(1)时间考察:称取AB-8型大孔树脂40 m L，加入制备好的厚朴样品液，密塞，室温振摇。在0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时分别用吸管吸取2 m L，测定其中目标物质的含量，确定吸附时间。由表7结果可知，吸附2小时，吸附已近乎完全，故确定吸附时间为2小时。
(2)上样量考察:取130 m L树脂湿法装入3 cm×38 cm的玻璃柱，以4 BV/h的速度上厚朴样品液，每100 m L为1份流出液，测定其中厚朴酚及和厚朴酚的量，绘制泄漏曲线。结果见表8、图1。
由泄漏曲线可知，该吸附条件下和厚朴酚最大上样量为600 m L，厚朴酚在上样500 m L出现明显泄漏，故最大上样量应在500 m L左右。为避免过载，确定最大上样量为400 m L，折合树脂与生药的比为1∶0.26(m L/g)。通过上述实验，确定AB-8型大孔树脂纯化厚朴的最佳条件为:上样量为树脂与生药比1∶0.26(m L/g)，吸附时间2小时。
表6 大孔树脂纯化厚朴树脂型号考察结果
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表7 大孔树脂纯化厚朴吸附时间考察结果

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表8 大孔树脂上样量考察结果

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2.3.3 洗脱条件考察


(1)浓度考察:装柱及上样操作过程同2.3.2，上样完成后静置2小时以充分吸附。洗脱:将已吸附好的树脂先用蒸馏水(2BV)洗至无色，再用20%乙醇(2BV)、40%乙醇(2 BV)、60%乙醇(4 BV)、80%乙醇(4 BV)、95%乙醇(4BV)依次洗脱。分段收集洗脱液，测定厚朴酚与和厚朴酚的量，优选洗脱溶剂，结果见图2。由图2可知，厚朴酚、和厚朴酚用80%乙醇洗脱时，有较高的洗脱量，因此选择80%乙醇作为洗脱液。

(2)用量考察:装柱及上样方法同上。洗脱:将已吸附好的树脂先用蒸馏水洗至无色，再用80%乙醇洗脱，流速为4BV/h。分段收集洗脱液，测定厚朴酚与和厚朴酚的总量，确定洗脱剂最佳用量，结果见图3。由图3可知，和厚朴酚在8BV基本洗脱完全，而厚朴酚在10BV基本洗脱完全;综合考虑两种酚的总量和经济性，选取10BV为洗脱剂用量。

通过上述实验，优选出的最佳洗脱条件为:先用水洗至无色(约2 BV)，再用10 BV的80%乙醇洗脱。

最终确定厚朴药渣中厚朴酚及和厚朴酚的提取纯化工艺为:取厚朴药渣，用10倍量60%乙醇回流提取2次，时间分别为90分钟、60分钟，过滤，合并滤液，减压浓缩至无醇味后，用AB-8型大孔树脂分离纯化，上样量为树脂与生药比1∶0.26(m L/g)，吸附2小时后，先用水洗至无色(约2 BV)，后用80%乙醇(10 BV)洗脱，合并洗脱液、减压浓缩、干燥，得厚朴粗提取物。经测定:粗提物出膏率约为4.56%，其中和厚朴酚含量约为19.94%，厚朴酚含量约为35.83%，两种酚的总含量约为55.77%。



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图1 大孔树脂纯化厚朴的泄漏曲线

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图2 大孔树脂纯化厚朴洗脱液浓度考察结果



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图3 洗脱液用量考察趋势结果





3 讨论
中药配方颗粒是以传统的中药汤剂为物质基础标准，经水提、浓缩、干燥、制粒而成。配方颗粒法定的提取溶媒为水溶液，不添加任何有机溶剂。因此配方颗粒所产生的药渣中，还残存有大量的脂溶性成分。而中药配方颗粒目前生产品种约600余种，据不完全统计几乎所有的药材中均含有脂溶性成分，目前配方颗粒的药渣多被作为废弃物进行处理，尚未有有效的处理方式，造成中药资源的严重浪费，也造成了环境污染问题。笔者通过对大黄、丹参、葛根、黄芪、夏枯草等一系列品种的研究，提供了一种药渣处理、重复利用的思路，并以厚朴为例阐述了经中药配方颗粒提取工艺后，废弃药渣中残留的脂溶性成分厚朴酚以及和厚朴酚的再次提取纯化工艺。所得的粗提取物可进一步纯化至较高纯度的单体化合物可出口至海外，亦可用于化妆品行业、兽药行业等下游市场。
随着中国中医药事业的快速发展，预计中医药大健康产业将有望达到3万亿元。据不完全统计，目前中国中药材年产量约7000万吨，而在制药企业进行工业化加工生产过程中，产生的中药废弃药渣可达3500万吨。中药配方颗粒也保持了快速增长态势，2006～2019年中药配方颗粒全国销售额由2.28亿元上升到125亿元，在2021年市场规模有望增加到约200亿元，未来几年有望达400亿。随着配方颗粒市场的发展，生产所用的药材年投料量也将由目前的上百万吨继续翻倍增长，再加上经典名方的开发上市，中药药渣的产生量会持续上升，采用填埋、焚烧、固定区域堆放等措施会对周围的水质、土壤和空气造成严重的污染，影响环境质量，且耗费大量资金。近年来，愈加突出和严重的药渣排放和处理问题，正成为制约中药制药行业发展的问题之一[10]。因此需要对中药材资源进行更加高效率的利用。