蛋白质特性与蛋白分离纯化技术的选择

蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有成千种不同的蛋白质。蛋白质的分离和提纯工作是一项艰巨而繁重的任务，到目前为止，还没有一个单独的或一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来，但对任何一种蛋白质都有可能选择一套适当的分离提纯程序来获取高纯度的制品。
蛋白质提纯的总目标是设法增加制品纯度或比活性，对纯化的要求是以合理的效率、速度、收率和纯度，将需要蛋白质从细胞的全部其他成分特别是不想要的杂蛋白中分离出来，同时仍保留有这种多肽的生物学活性和化学完整性。
8 {9 g+ c- x: }- n3 S5 Y能从成千上万种蛋白质混合物中纯化出一种蛋白质的原因，是不同的蛋白质在它们的许多物理、化学、物理化学和生物学性质有着极大的不同，这些性质是由于蛋白质的氨基酸的序列和数目不同造成的，连接在多肽主链上氨基酸残基可是荷正电的、荷负电的、极性的或非极性的、亲水的或疏水的，此外多肽可折叠成非常确定的二级结构（α螺旋、β折叠和各种转角）、三级结构和四级结构，形成独特的大小、形状和残基在蛋白质表面的分布状况，利用待分离的蛋白质与其它蛋白质之间在性质的差异，即能设计出一组合理的分级分离步骤。
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" D% b2 \& H& I0 H可依据蛋白质不同性质与之相对应的方法将蛋白质混合物分离：
9 f$ L% n+ d/ }1 K. q" y1．分子大小不同种类的蛋白质在分子大小方面有一定的差别，可用一些简便的方法，使蛋白质混合物得到初步分离。
2 b9 d% a& N& O; F" m8 @1．1透析和超滤
透析在纯化中极为常用，可除去盐类（脱盐及置换缓冲液）、有机溶剂、低分子量的抑制剂等。透析膜的截留分子量为5000左右，如分子量小于10000的酶液就有泄露的危险，在纯化中极为常用，可除去盐类、有机溶剂、低分子量的抑制剂等。超滤一般用于浓缩和脱色
' Z8 \& B. k7 Z' [$ n/ a* L) [  R1．2离心分离置换缓冲液
许多酶富集于某一细胞器内，匀浆后离心得得到某一亚细胞成分，使酶富集10~20倍，再对特定的酶进行纯化。差速离心，分辨率较低，仅适用于粗提或浓缩。速率区带法，如离心时间太长所有的物质都会沉淀下来，故需选择最佳分离时间，可得到相当纯的亚细胞成分用于进一步纯化，避免了差速离心中大小组分一起沉淀的问题，但容量较小，只能用于少量制备。等密度梯度离心常用的离主介质有蔗糖、聚蔗糖、氯化铯、溴化钾、碘化钠等等
1．3凝胶过滤
9 |+ w, E; M) F* ~7 g这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一，注意使要离的蛋白质分子量落在凝胶的工作范围内。选择不同的分子量凝胶可用于脱盐、置换缓冲液及利用分子量的差异除去热源。
; d9 V' q$ N' e% M2．形状蛋白质在离心通过溶液运动时，或通过膜、凝胶过滤填料颗粒或电泳凝胶中的小孔运动时，都会受到形状的影响：对两种相同质量的蛋白质而言，球状蛋白质具有较小的有效半径（斯托克半径），通过溶液沉降时遇到的摩擦力小，沉降较快而显得比其它形状的蛋白质大；反之，在体积排阻色谱时，斯托克半径较小的球状蛋白质更容易扩散进入凝胶过滤填料颗粒内部，较迟洗脱出来，因而显得比其它形状的蛋白质要小。

3．溶解度利用蛋白质的溶解度的差别来分别各种蛋白质常用的方法。影响蛋白质溶解度的外界因素很多，其中主要有：溶液的pH、离子强度、介电常数和温度，但在同一的特定外界条件下，不同的蛋白质具有不同的溶解度。适当改变外界条件，控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度
2 u6 n& u* p6 f7 C0 f. K% i3．1pH控制和等电点沉淀
& a- X' w0 _; W% `蛋白质在其等电点一般较不易溶解。
3．2蛋白质的盐溶和盐析
3．3有机溶剂分级法
蛋白质在不同的溶剂中的溶解度有很大不同，从基本不溶（＜10μg/ml）直至极易溶解（＞300mg/ml）不等。影响蛋白质溶解度的可变因素包括温度、pH、溶剂的极性、离子性质和离子强度。引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同，故控制有机溶剂的浓度可分离蛋白质。
水溶性非离子聚合物如聚乙二醇也能引起蛋白质的沉淀。
0 {. y7 x* @$ \& z1 S( D% m' L; {3．4温度
4 S( C! p3 |- x6 a( p# K不同的蛋白质在不同的温度具有不同的溶解度和活性。大多数蛋白质在低温下比较稳定，故分离操作一般在0℃或更低温度下进行。

' O% G- c7 V) `4．电荷蛋白质净电荷取决于氨基酸残基所带的正负电荷的总和，如中性溶液中带净负电荷则称为酸性蛋白质，
: L* i9 D2 S, N# E. U- T0 I* @' G4．1电泳
$ M( Q5 `0 ?8 g不仅是分离蛋白质混合物和鉴定蛋白质纯度的重要手段，而且也是研究蛋白质性质很有用的方法。
; n) D: a3 i+ f% q2 Y等电聚焦分辨率很高，pI有0.02pH的差异就能分开。
% j( h4 B! z6 r6 J/ f2D-PAGE分离蛋白质分辨率已经发展到100000个蛋白点。
% V" b: ^7 Y$ N* {4．2离子交换层析
0 J" ?( g6 A" E2 B4 {& z改变蛋白质混合物溶液中的盐离子强度、pH和（阴、阳）离子交换填料，不同蛋白质对不同的离子交换填料的吸附容量不同，蛋白质因吸附容量不同或不被吸附而分离。
洗脱可采用保持洗脱剂成分一直不变，也可采用改变洗脱剂的盐度或pH的方法洗脱，后一种可分分段洗脱和梯度洗脱。梯度洗脱一般效果好，分辨率高，特别是使用交换容量小，对盐浓度敏感的离子交换剂，多用梯度洗脱。控制洗脱剂的体积（与柱床体体积相比）、盐浓度和pH，样品组分能从离子交换柱上分别洗脱下来。
蛋白分子暴露在外表面的侧链基团的种类和数量不同，故在一定的PH值和离子强度的缓冲液的所带的电荷不同。
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2 P8 L9 S1 ^$ e5．电荷分布电荷的氨基酸残基可均匀地分布于蛋白质的表面，既可以适当的强度与阳离子交换柱结合也能以适当强度与阴离子结合，因多数蛋白质都有不能在单一的溶剂条件下同时与两种类型的离子交换柱结合，故可得用此性质纯化；电荷的氨基酸残基亦可成簇分布，使某一区域带强正电荷而另一区域带强负电荷，呈强酸性或强碱性，只能在极端pH与阳离子交换树脂或阴离子交换树脂结合，如钙调蛋白只能在pH2时与阳离子交换树脂结合。
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6．疏水性多数疏水性的氨基酸残基藏在蛋白质的内部，但也有一些在表面。蛋白质表面的疏水性氨基酸残基的数目和空间分布决定了该蛋白质是否具有与疏水柱填料结合从而利用它来进行分离的能力。
因其廉价和纯化后的蛋白质具有生物活性，是一种通用性的分离和纯化蛋白质的工具。高浓度盐水溶液中蛋白质在柱上保留，在低盐或水溶液中蛋白质从柱上被洗脱，故特别适用于浓硫酸铵溶液沉淀分离后的母液以及该沉淀用盐溶解后的含有目标产品的溶液直接进样到柱上，当然也适用7mol/盐酸胍或8mol/L脲的大肠杆菌的治疗蛋白质提取液直接进样到柱上，在分离的同时也进行了复性。
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# @; L. P5 D4 Z0 i  b. \7．密度多数蛋白质的密度在1.3~1.4g/cm3之间，分级分离蛋白质时一般不常用此性质，不过对含有大量磷酸盐或脂质的蛋白质与一般蛋白质在密度上明显不同，可用密度梯度法离心与大部分蛋白质分离。
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8．基因工程构建的纯化标记通过改变 cDNA在被表达的蛋白的氨基端或羧基端加入少许几个额外氨基酸，这个加入的标记可用来作为一个有效的纯化依据。
8．1GST融合载体
使要表达的蛋白质和谷胱甘肽S转移酶一起表达，然后利用Glutathione Sepharose 4B作亲和纯化，再利用凝血酶或因子Xa切开。
6 U$ d8 I6 R/ P- L% {8．2蛋白A融合载体
+ ?% L% B1 \% J8 U/ T使要表达的蛋白和蛋白A的IgG结合部位融合在一起表达，以IgG Sepharose纯化。
8．3含组氨酸标记（Histidine-tagged）Chelating Sepharose
最通行的标记之一，是在蛋白质的氨基端加上6~10个组氨酸，在一般或变性条件（如8M尿素）下借助它能与Ni2+螯合柱紧紧结合的能力，用咪唑洗脱，或将pH降至5.9使组氨酸充分质子化，不再与结合Ni2+使之得以纯化。
4 w& v# p5 j4 T) R重组蛋白在设计、构建时已融入纯化构想。样品多夹杂了破碎细胞或可溶产物，扩张床吸附技术STREAMLINE适合做粗分离。
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9．亲和能力结合效率高，分离速度快的特点。配基可是酶的底物、抑制剂、辅因子、特异性的抗体、
: z  U) Y0 y2 t, O; O0 ~: h吸附后可改变缓冲液的离子强度和PH的方法，洗耳恭听脱下来，也可用更高浓度的同一配体溶液或亲和力更强的配体溶液洗脱
7 A8 m3 z" d$ A2 ~7 W' F) e8 Z亲和层析固定相的配基与生物分子之间的特殊的生物大分子亲和能力不同来进行相互分离的，依亲和选择性的高低分为：基团性亲和层析，固定相上的配基对一类基团的极强的亲和力。如含有糖基的一类蛋白质或糖蛋白对三嗪染料显示特别强的吸附能力；高选择性（专一性）亲和层析，配基仅对某一种蛋白质有特别强的亲和性。如单克隆抗体对抗原的特异性的吸附。
- k, b! I3 ?6 s9 Q/ Z( ~6 c5 H亲和层析除特异性的吸附外，仍然会因分子的错误认别和分子间非选择性的作用力而吸附一些杂蛋白质，另洗脱过程中的配体不可避免的脱落进入分离体系。
5 k' M5 D5 {  a9 @与超滤结合起来，将两者优点集中形成超滤亲和纯化，具有高分离效率和大规模工业化的优点，适用于初分离。
% L' U! E; |/ T1 x按配基的不同可分为：
（1）金属螯合介质
过渡金属离子Cu2＋、Zn2＋和Ni 2＋等以亚胺络合物的形式键合到因定相上，由于这些金属离子与色氨酸、组氨酸和半胱氨酸之间形成了配价键，从而形成了亚胺金属—蛋白螯合物，使含有这些氨基酸的蛋白被这种金属螯合亲和色谱的固定相吸附。螯合物的稳定性受单个组氨酸和半胱氨酸解离常数所控制，从而亦受流动相的pH和温度的影响，控制条件可以使不同蛋白质相互分离。
（2）小配体亲和介质
配体有精氨酸、苯甲酰胺、钙调因子、明胶、肝素和赖氨酸等等。
* n0 O/ p9 t) s+ U- i% E) r6 b（3）抗体亲和介质
即免疫亲和层析，配体有重组蛋白A和重组蛋白G，但蛋白A比蛋白G专一，蛋白G能结合更多不同源的IgG。
（4）颜料亲和介质
染料层析的效果除主要取决于染料配基与酶的亲和力大小外，还与洗脱缓冲液的种类、离子强度、PH值及待分离的样品的纯度有关。配体有Cibacron Blue和Procion Red两种。在一定的条件下，固定化的染料能起阳离子交换剂的作用，为了避免此现象的发生，最好要离子强度小于0。1和PH大于7时操作。
0 ~6 T, m* h( b$ [# [4 t; w（5）外源凝集素亲和介质
5 {2 c( u1 |/ u: {( O# g3 ~配体有刀豆球蛋白、扁豆外源凝集素和麦芽外源凝集素，固相外源凝集素能和数种糖类残基发生可逆反应，适合纯化多糖、糖蛋白。
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10．非极性基团之间作用力溶质分子中的非极性基团与非极性固定相间的相互作用力（非选择性分散力或伦敦力）大小与溶质分子极性基团与流动力相中极性分子在相反方向上相互作用力的差异进行分离。因其流动相中的置换剂是极性小于水的有机溶剂（如甲醇、乙腈、四氢呋喃等），这些有机溶剂可能使许多蛋白质分子产生不可逆的变性；流动相中须有离子对试剂（如三氟乙酸、甲酸、磷酸等）存在才可使分离有效地进行和获得高的质量回收率；分离须在酸性介质中进行（一般pH在2~3之间），又有一些蛋白质会在后两种条件下产生不可逆的分子构象变化，故在生物大分子中人分离纯化中受到限制，但分子构象变化可逆的蛋白质而言是有效的方法。
正相色谱在生物大分子中的分离和纯化中应用相对较少，因所用的溶剂很贵。
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11．可逆性缔合在某些溶液条件下，有一些酶能聚合成二聚体、四聚体等，而在另一种条件下则形成单体，如相继在这两种不同的条件下按大小就可以进行分级分离。
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- i+ e& U( i, c& o12．稳定性12．1热稳定性
大多数蛋白质加热到95℃时会解折叠或沉淀，利用这一性质，可容易地将一种经这样加热后仍保持其可溶性活性的蛋白质从大部分其它细胞蛋白质中分离开。
12．2蛋白酶解稳定性
$ M( {! V5 y) G% r1 Y用蛋白酶处理上清液，消化杂蛋白，留下抗蛋白酶解抗性蛋白质。
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13．分配系数即利用双水相萃取分离，常用的生物物质分离体系有：聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（DEXTRAN）、PEG/磷酸盐、PEG/硫酸铵等。由于具有含水比例高、选用的聚合物及盐对酶无毒性、分离设备与化学工业通用等优点，在工业上目益受重视。
! |" x, d) I5 a, _6 Q2 `分配行为受聚合物分子大小、成相浓度、PH、无机盐种类等因素影响，
7 H7 ?5 v  ~: z发展：具有亲和双水相萃取及膜分离双水相萃取等新型双水相分离技术。
双向水溶液系统的蛋白质纯化
一些与水混合多聚物的不相溶性导致依赖于多聚物浓度的两相系统的液-液分配技术，可以由两不同的高水溶性的多聚物或一种多聚物各一种盐，用于从微生物匀浆中除支细胞碎片、后续分配步骤进一步纯化。分离的选择性一般随着分离分子或颗粒大小面增加。
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- V& p( c* N. k/ I+ P/ r14．表面活性14．1泡沫分离
蛋白质溶液具有表面活性，气体在溶液中鼓泡，气泡与液相主体分离，在塔顶富集，达到分离和浓缩的目的。
% `3 z0 X6 w* ]( C, [14．2反胶团相转移法
反胶团相转移法是80年代兴起的一种新型分离技术，它利用表面活性剂分子在有机溶剂中自发形成的反向胶团（反胶团），在一定条件下将水溶性蛋白质分子增溶进反胶团的极性核（水池）中，再创造条件将蛋白质抽提至另一水相，实现蛋白质的相转移，达到分离和提纯蛋白质的目的。反胶团中的蛋白质分子受到周围水分子和表面活性剂极性头的保护，仍保持一定的活性，甚至表现出超活性。由于蛋白质增溶于反胶团与蛋白质所带电荷及反胶团内表面电荷间的静电作用及反胶团的大小有关，因而表面活性剂的种类、水溶液的pH值及离子强度等因素均影响反胶团对蛋白质的相转移。据报道利用AOT／异辛烷反胶团对酵母脂肪酶进行相转移。
14．3聚合物-盐-水液-固苯取体系是90年代在国内开发的种新的萃取体系，成功地用于萃取金属离子及卞果酸脱氢酶等生物活性物质较强的吸附及乳化作用等缺陷，成相容易成相后直接倾出液相即可使液固的相分离，勿需特殊技术处理，不用有机溶剂，无毒性，成相聚合物及盐对生物活性物质有稳定和保护作用，萃取分离选择性好消耗低、易于规模放大的分离生队物活件物质的新技术在聚乙二醇修饰物的聚乙二醇／葡聚糖双水相萃取体系共价作用：主要用于含巯基酶的纯化，通过共价键结合在层析介质上，偶联是可逆的，能还原二硫键的低分子化合物洗脱，如空间位阻，可在含变性剂的缓冲液时吸附，如已含二硫键，则先用还原剂打开。
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