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安捷伦色谱技术小讲堂--峰分叉原因分析2015-04-14 [url=]安捷伦科技生命科学[/url]3 y3 W+ h$ u4 C* o k
峰分叉原因分析 一、色谱柱污染 在开始时没问题，在使用一段时间后出现这个问题，可能是由于污染引起的。这时需要对色谱柱加强冲洗，即使用比方法流动相更强的溶剂冲洗色谱柱。图1中使用纯乙腈冲洗色谱柱消除了3号峰分叉问题。 1 l& F% m" [- N9 P' K0 i1 W9 Y
图1 保护柱失效 0 s0 M* X1 r/ d4 ]' n
如果样品基质比较脏，使用一段时间之后，发现的峰分叉或拖尾等问题，很有可能是保护柱失效造成的。一般粗略判断标准，塔板数、压力或分离度的改变超过 10%，就需要更换保护柱了。保护柱是消耗品，建议直接更换，不需要再生。 接头连接不正确 " x0 x* H* ?' j# W
如果色谱柱在使用过程中发现每个峰的峰形都出现问题，先考察是否有连接问题。 管线可能太长或太短——这种情况可能导致渗漏或峰分叉/拖尾，如图2所示。如果管线太长，密封圈位置不当，将发生渗漏。如果管线推出的距离不够，将会产生一段死空间，形成混合腔，导致柱外体积，使峰形变坏。如果您使用的是不同厂商的色谱柱，一定要确保使用正确的接头，并保证色谱柱末端接头位置正确。 / P+ L5 P {1 Y% [$ p+ S" I# B
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图2 安捷伦推荐带前后垫圈的 Swagelok 型接头，能让安捷伦液相色谱系统获得最佳性能。在所有仪器连接处都可以使用这种接头，包括阀、加热器、连接色谱柱等。进行良好连接的步骤如图3： 图3 3 P& A* E$ m: a5 ^. U
在反相 LC 中， 如使用 100% 有机溶剂或 100% 强溶剂（图4中为乙腈），大体积进样时，将使色谱峰过早洗脱出色谱柱，导致峰变形。如需解决这个问题可以对分析物进行蒸发浓缩，从而减少进样体积。或者进样溶剂改为用水稀释，与流动相更为兼容，即使进样体积较大也不会出现峰变形。较早流出的峰或靠近溶剂前沿的峰更容易出现拖尾。在液相色谱中用溶于流动相的小体积进样最为理想。
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+ a) l! R7 X5 `图4 % \7 s# {: O+ Q7 w
样品过载
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当进样量超过柱子的容量，样品峰会呈现分叉或拖尾，解决方案就是减少进样量。这种问题一般在使用小体积色谱柱是表现更为明显，所以色谱柱方法从常规250mm或150mm长色谱柱转化到体积较小的快速分析柱时，进样量要按照柱体积的减小的比例而减小。 色谱柱塌陷 + p) b3 X. a: V4 A% V7 a* N: ~
由于柱塌陷引起的峰分叉，很难修复。如果流动相pH>7或在色谱柱pH耐受范围临界点附近长时间使用，是比较容易造成硅胶填料溶解塌陷。如果出现色谱柱塌陷，您会看到色谱图中的每个峰峰形都会发生变化（峰拖尾、加宽或分叉）如图5，短时间内可以反方向运行，建议直接更换色谱柱。日常使用的过程中注意将温度降低到 40 ℃以下，特别是使用高 pH 流动相时；使用高温兼容色谱柱，如立体保护的硅胶柱、混合型柱、聚合物柱、氧化锆柱等。使用特别适合在较高 pH 下操作的高覆盖率或双交联固定相（比如，ZORBAX Extend-C18），或使用聚合物、混合型或氧化锆反相柱。 图5 （a）正常；（b）（c）柱塌陷
( k; e( [$ P* M( T( [* D柱前筛板部分堵塞 : q# E' n! Q0 G" K
长期分析脏样品，如果没有保护柱或在线柱前过滤器，颗粒物和强吸附物很可能在柱入口筛板发生堵塞，同时伴随着压力升高，解决办法一般是色谱柱反冲。1.8um粒径的色谱柱尽量避免反冲。由于现在使用的是高效装柱工艺，不建议更换色谱柱入口筛板，在许多色谱柱上也不可能更换。如果更换筛板，可能影响柱效。所以最好在色谱柱前安装在线过滤器（部件号5067-4638）和保护柱。 色谱柱性能下降 ! A4 {% ^7 n& ]0 w6 n% t
在您使用色谱柱时，会用其分析各种目标物、使用各种流动相并分离不同的样品基质，经过长时间的使用，色谱柱会受到这些物质的影响发生一些微妙的变化，从而引起峰分叉、拖尾或保留时间的改变。在使用新色谱柱时保留其测试样品色谱图非常重要，在使用一段时间后进行比较，就能发现性能上的变化。如果分离度下降导致不能进行良好定量，这根色谱柱就应该丢弃并更换了。 7 O1 ] `# O# E1 H( b6 b1 A
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